丁香酚與丁香醛縮二甲醇聯合抗氧化作用研究

方雪祥,袁慧慧,單艷超,藍閩波

(華東理工大學化學與分子工程學院,上海市功能性材料化學重點實驗室,上海 200237)

丁香酚(2-allyl-4-methoxyphenol,Eugenol)又名子丁香酚,化學名為2-甲氧基-4-烯丙基苯酚,是植物丁香、丁香羅勒以及樟樹屬肉桂葉揮發油的主要成分,常溫下為黏稠的淡黃色油狀液體,呈現出特殊辛辣味和強烈的丁香氣息[1]。作為一種天然香料,Eugenol還有很好的抗氧化活性[2-3]。Leopold等[4]發現Eugenol具有與BHA(丁基羥基茴香醚)幾乎相等的DPPH·自由基清除能力,在檢測羥基自由基清除能力的實驗中還發現，Eugenol具有極強的金屬螯合能力,大約是同濃度下槲皮素的十倍。因此可以作為一種具有防腐作用、矯味作用和抗氧化作用的食品添加劑[5]、藥物輔料和膳食補充劑。同時,Eugenol可通過降低氧化應激水平抑制大鼠腎缺血再灌注性損[6];能提高心肌細胞超氧化歧化酶(SOD)活性,增強清除超氧自由基陰離子能力,阻斷脂質過氧化反應,對H2O2誘導的H9C2細胞損傷具有一定的保護作用[7],其抗氧化[8]、抗炎等藥理活性也越來越受到廣泛關注。

以課題組前期研究[16-17]為基礎,在研究天然抗氧化劑的協同作用過程中,我們發現Eugenol和丁香醛(一種香蘭素的衍生物,廣泛的存在于核桃等植物中[18])在甲醇溶液中久置前后的聯合抗氧化作用有明顯差異,通過進一步研究發現丁香醛與甲醇反應的產物-丁香醛縮二甲醇(syringaldehyde dimethylacetal(SGD))和Eugenol產生協同抗氧化作用。本文通過研究Eugenol和SGD復配比例對協同抗氧化效果的影響,初步探討了協同作用機制,為發揮Eugenol優異的抗氧化性能,提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Eugenol、α-生育酚、無水甲醇 上海阿拉丁生化科技有限公司;二苯代苦味酰自由基(DPPH·) sigma-aldrich公司;SGD 自制,采用Yukihito等[19]報道的合成方法。

Evolution 220紫外可見分光光度計 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;UHD Accurate Mass Q-TOF高分辨液質聯用儀、1260 Infinity高效液相色譜儀 安捷倫科技(中國)有限公司;A SH-Ⅲ循環水式真空泵 上海羌強儀器設備有限公司;FA2004電子天平 上海良平儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同抗氧化劑對DPPH·的清除作用 DPPH·清除實驗參照文獻[20]的方法,并在此基礎上根據實際需要稍作修改。分別取不同濃度的Eugenol,SGD和α-生育酚供試品溶液2.0 mL與2.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH·溶液在PE管中充分混合。α-生育酚作為陽性對照,等量的無水甲醇作為空白對照。將混合溶液放入暗處,常溫反應30 min,用紫外分光光度計于517 nm處檢測其吸光度。DPPH·清除率采用公式1計算:

式(1)

其中A1為供試品溶液在517 nm波長處的吸光度,A0為空白甲醇溶液在517 nm處的吸光度,結果以供試品溶液DPPH·清除率達到50%時的濃度,即IC50表示。IC50值越小表明樣品的自由基清除能力越強。

1.2.2 Eugenol與SGD對DPPH·的聯合清除作用 以Eugenol和SGD摩爾比為5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶5,配制復合抗氧化劑,按照1.2.1的方法,測定復合抗氧化劑的DPPH·清除活性。

1.2.3 協同作用分析 等效線分析法(Isobologram)被用于協同抗氧化研究,常用于判斷藥物之間的相互作用,被看作是評價藥物相互作用的“黃金標準”。其中相互作用指數(λ)可用來判斷相互作用強度,能為抗氧化劑的最佳配比提供理論依據[21-22]。

式(2)

注:IC50A和IC50B分別表示抗氧化劑A、B單獨作用時的IC50值,IC50Amix和IC50Bmix分別表示復合抗氧化劑中A,B的濃度。

如果λ<0.9,表現為協同作用;λ>1.1,表現為拮抗作用;0.9<λ<1.1則為加和作用。而且λ值越小協同作用越強,λ值越大,拮抗作用也越強[23]。

1.2.4 不同抗氧化劑對DPPH·清除效果隨時間的變化對比 配制12.5 μmol/L和25.0 μmol/L Eugenol甲醇溶液,25.0 μmol/L和50.0 μmol/L SGD的甲醇溶液。取12.5 μmol/L、25.0 μmol/L Eugenol甲醇溶液、25.0 μmol/L SGD的甲醇溶液、復合抗氧化劑甲醇溶液(含12.5 μmol/L Eugenol和25.0 μmol/L SGD)各2.0 mL分別與2.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH·溶液在PE管中充分混合。以等量的無水甲醇作為空白對照。將上述混合溶液放置暗處,常溫反應。每隔1 min用紫外分光光度計于517 nm處檢測并記錄溶液的吸光度,直至吸光度值基本不變。

1.2.5 復合抗氧化劑與DPPH·反應產物分析 供試品制備:配制0.25 mmol/L、0.50 mmol/L Eugenol甲醇溶液和0.50 mmol/L、1.00 mmol/L SGD的甲醇溶液,分別取0.25 mmol/L Eugenol甲醇溶液和0.50 mmol/L SGD的甲醇溶液以及復合氧化劑甲醇溶液(含0.25 mmol/L Eugenol和0.50 mmol/L SGD)各2.0 mL 與2.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH·溶液在PE管中充分混合,放置暗處,常溫反應30 min,經0.45 μm濾膜過濾,用高效液相色譜儀檢測,以Eugenol、SGD和DPPH·三種反應物作為對照。分離純化復合抗氧化劑與DPPH·反應的關鍵產物,用高分辨液質聯用儀檢測。

高效液相色譜條件:流動相為甲醇(A)和水(B);梯度洗脫條件:0～40 min,40%～100% A;檢測波長:265 nm;流速:1.0 mL/min;進樣體積:10 μL;柱溫:30 ℃。

農業科研活動具有內在的特殊性和科技成果的外部性，需要采用適合的評價指標體系。評價體系中引入中長期影響因素，為真實反映出農業科研項目的績效，筆者認為評價指標中應當包括成果轉化效益指標和發展能力指標，以反映中長期影響因素。引入成果轉化指標旨在促進科研與市場對接，激勵農業科技成果轉化，將財政對農業科研經費的投入轉化成農業現實生產力的進步。引入發展能力指標，主要是把科研單位整體實力提升納入評價范圍，包括人才培養與流動，條件改善等方面的內容，這將有利于引導科研人員更加關注農業科研項目的長期影響，全面反映農業科研項目的長期效益。

高分辨液質聯用儀測試條件。色譜條件:流動相為甲醇(A)和水(B);等度洗脫:甲醇/水(50/50),流速為0.2 mL/min;進樣體積1 μL;柱溫:30 ℃。質譜條件:ESI正離子檢測;離子源350 ℃;干燥氣(N2)流速10 L/min,霧化氣(N2)氣壓45 psi;毛細管電壓3000 V;一級全掃描(m/z 100～1000)。

1.3 數據處理

所有實驗平行測定三次,結果用平均值±標準偏差表示。Statistical Product and Service Solutions 19.0 軟件(IBM)對實驗數據進行單因素方差分析,檢測實驗測定的IC50值(IC50 mix)與理論的IC50值(IC50add)之間是否具有顯著性差異,如果顯著性差異值P<0.05,則二者有顯著性差異。

應用Sigmaplot12繪制Isobologram分析圖,對復配混合物的聯合清除DPPH·能力進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同抗氧化劑對DPPH·的清除作用

圖1為三種抗氧化劑在不同濃度下(選定的濃度皆為IC50值附近的濃度)對DPPH·清除率。計算得到各抗氧化劑的IC50值分別為:Eugenol:22.23 μmol/L;α-生育酚:23.14 μmol/L;SGD:331.38 μmol/L。可以看出Eugenol抗氧化活性與α-生育酚相當,SGD抗氧化活性較低,僅為前者的十五分之一左右。

圖1 Eugenol、SGD和α-生育酚對DPPH·清除能力Fig.1 DPPH free radical scavenging activity of eugenol,SGD and α-tocopherol

2.2 Eugenol與SGD對DPPH·的協同清除作用

表1和圖2給出了Eugenol與SGD不同復配比例對協同抗氧化能力的影響。由表1可知,隨著復合抗氧化劑濃度的增加,其對DPPH·的清除率也逐漸增大。等效線分析圖(圖2)可直觀地看出在給定的7個比例復配后的抗氧化劑測得的IC50值在等效線分析圖上的落點均在理論加和線下方,表明7個比例下復配的復合抗氧化劑都具有協同抗氧化作用[21,24]。

表1 Eugenol與SGD復合抗氧化劑清除DPPH·能力Table 1 DPPH radical scavenging capacity of eugenol and SGD composite antioxidants

圖2 Eugenol和SGD聯合抗氧化的等效線分析圖Fig.2 Isobolograms for the interaction of eugenol and SGD注:F(5∶1)、F(3∶1)、F(2∶1)、F(1∶1)、F(1∶2)、F(1∶3)、 F(1∶5)在圖中分別表示Eugenol與SGD濃度的比例為 5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶5。

采用t檢驗對IC50 add和IC50 mix進行統計比較,若IC50 mix

表2 不同配比Eugenol和SGD的IC50及λTable 2 Experimental,theoretical IC50 and the interaction index values for eugenol and SGD with different ratio

注:與IC50add對比***P<0.001,**P<0.01,and*P<0.05。

Eugenol與SGD復配比例在1∶2和1∶3時，其λ值相當且最小,考慮增加SGD的量對協同作用貢獻度不大,因此認為Eugenol和SGD比例為1∶2時具有最佳的協同抗氧化作用。

2.3 不同抗氧化劑對DPPH·的清除效果隨時間的變化

圖3 單一和復合抗氧化劑與DPPH· 反應吸光度(517 nm)隨時間的變化Fig.3 Absorbance change of DPPH· scavenging assay at 517 nm in the presence of single or combined antioxidant

2.4 單一和復合物抗氧化劑與DPPH·反應的產物分析

為了進一步探究協同作用機制,采用HPLC對Eugenol,SGD以及兩者的復合抗氧化劑與DPPH·反應的產物進行了分析,出峰情況如圖4。

圖4 單一以及復合抗氧化劑 與DPPH·反應產物的HPLC譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of the products of DPPH· radical scavenging reactions in the presence of single or combined antioxidant

圖4中1和2號峰分別為Eugenol和SGD的信號峰。通過對比未加任何抗氧化劑的DPPH·的HPLC譜圖,可推斷4、5為Eugenol單獨與自由基反應的主要產物,而SGD單獨與自由基反應活性低,產物較多且生成量少,從圖譜上看主要有6、7產物峰。8號產物峰只出現在復合抗氧化劑清除自由基的反應中,從而可以推斷8號產物可能與Eugenol和SGD協同抗氧化作用有關。且通過對比單一抗氧化劑和復合抗氧化劑與DPPH自由基反應產物,可以明顯的看出復配后,各單一抗氧化劑原有的自由基反應產物4、5、7等有了不同程度的減少甚至消失,這可能與復合抗氧化劑與自由基反應機制發生改變,更多的向著生成新產物8的方向進行。

圖6 推測的協同反應機制Fig.6 Possible synergistic antioxidant mechanism of eugenol and SGD on DPPH· scavenging

將8號產物分離富集后進行高分辨質譜分析,正離子模式下質譜圖信號為389.1596。通過對反應可能生成的產物以及分子量的精確計算,最后得出了該化合物可能的結構式如圖5所示,命名為:4-((E)-3-(2,6-二甲氧基-4-(二甲氧甲基)苯氧基)烯丙亞基)-2-甲氧基環己-2,5-二烯酮。該化合物在正離子模式下的理論準確分子量為389.1595,與質譜圖信號389.1596相差0.0001。

圖5 產物8的高分辨質譜圖(m/z 300～640) 及可能的分子結構式Fig.5 High resolution mass spectrum(m/z 300～640) and possible molecular structure of the product 8

2.5 反應機制推導

根據質譜分子量信息推測的分子結構以及文獻報道,推導出可能的反應機制如圖6。Bondet等[25]的報道,Eugenol單獨與DPPH·反應,主要有a,b兩個途徑,這兩種途徑都是一分子的Eugenol清除兩分子的DPPH·。而復合抗氧化劑中SGD與DPPH·的反應活性雖然很低,但其與DPPH·反應后所得SGD自由基能與b途徑生成的醌類化合物反應,所得產物可再與一分子的DPPH·反應生成產物8。因此復合抗氧劑中一分子Eugenol清除DPPH·沿著醌類產物途徑,將消耗四分子的DPPH·,其清除能力約為單一Eugenol抗氧化劑的2倍,這與2.3中得出的結果吻合。

3 結論

研究采用DPPH·清除法和等效線分析法評價了Eugenol與SGD在不同比例復配下抗氧化的相互作用,發現在測試的比例下兩者均表現出顯著的協同抗氧化作用,最佳協同比例為Eugenol∶SGD 1∶2。采用HPLC分析復合抗氧化劑與DPPH·的反應產物,發現并分離得到了產物8,結合其高分辨質譜分子量等信息,推測出產物8為4-((E)-3-(2,6-二甲氧基-4-(二甲氧甲基)苯氧基)烯丙亞基)-2-甲氧基環己-2,5-二烯酮,從而推導出復合抗氧劑的協同抗氧化機理,反應中可消耗醌類產物,且其抗氧化能力相當于單一Eugenol抗氧化能力的2倍,因此使用復合抗氧劑,不僅可以減少Eugenol的用量,從而避免其高濃度下促氧化的風險,還可減少醌類物質所引起的細胞毒性,從而極大地提高了Eugenol在抗氧化方面的應用。