補腎化痰方影響去勢骨質疏松大鼠Leptin及β2-AR表達的實驗研究*

李章青 ，向 楠 ，周廣文，張 麟 ，張 妍 ，譚張奎，黃詩怡

（1.湖北中醫藥大學，武漢 430065；2.武漢市中西醫結合醫院，武漢市第一醫院，武漢 430022）

絕經后骨質疏松癥是一種由于女性絕經后雌激素水平急劇下降，導致骨重建動態平衡被打破，破骨細胞的骨吸收速度大于成骨細胞的骨形成速度，使得骨丟失加快的全身性代謝性疾病[1]。此外，研究顯示雌激素減少與脂代謝異常存在密切關系[2]。學者們發現，瘦素（Leptin）具有廣泛的生物學效應，參與脂代謝與骨代謝的過程，并起到至關重要的作用[3]。雌激素的水平也被證實對Leptin有影響[4]。因此，本實驗以Leptin為切入點，在建立去勢骨質疏松大鼠模型基礎上，通過Leptin對交感神經系統β2腎上腺素能受體（β2-AR）的影響，進一步明確補腎化痰方防治絕經后骨質疏松癥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物制備 補腎化痰方（菟絲子30 g，淫羊藿10g，補骨脂 15g，全瓜蔞 15 g，紅曲 12g，山楂 20 g），并在本院制劑室煎煮濃縮，生藥含量為0.94 g/mL[5]，存于4℃冰箱備用。陽性對照藥：替勃龍片（利維愛，H20051085），阿托伐他汀片（阿樂，H19990258）。

1.1.2 實驗動物 6月齡SPF級未孕雌性SD大鼠75只，體質量270～300 g，由湖北省赤壁市實驗中心提供，動物許可證號（鄂）42000600017470。在湖北中醫藥大學動物實驗中心飼養，所有動物飼養在恒溫（22～24℃）、恒濕（50%～60%）、12/12 h循環光照條件下，自由飲水、進食。定期更換墊料，保持鼠籠清潔干凈，排除環境等外界因素對實驗結果的影響。

1.1.3 實驗試劑 酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，大鼠Leptin試劑盒（E-EL-R0582c）、雌二醇（E2）試劑盒（E-EL-0065c）；總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測定均采用試劑盒，購于長春匯力生物技術有限公司；大鼠Leptin、β2-AR引物合成購于廣州擎科生物科技有限公司。

1.1.4 實驗儀器 微計算機斷層掃描技術（Micro-CT，skyscan 1176）、微型高速離心機（Labnet）、全自動生化分析儀（Rayto）、全自動酶標儀（Thermoscientific）、實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（ABI7900/illuminaeco）、PCR儀（東勝創新生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 建立模型與分組 大鼠適應性喂養1周，隨機分為假手術組、模型組、補腎化痰組、利維愛組、阿托伐他汀組，每組15只，假手術組保留卵巢，僅切除卵巢周圍同等質量的脂肪組織，分層縫合傷口；其他各組行雙側卵巢切除術。經腹腔注射10%水合氯醛（30 mg/kg）麻醉，大鼠俯臥位備皮消毒，從背側正中切口，找到卵巢，結扎摘除雙側卵巢組織后縫合。術后肌注青霉素4萬U/（只·d）[6]，連續3 d，觀察大鼠傷口感染情況及精神狀況，第5周開始灌胃給藥。根據人類與動物同類藥物等效劑量的換算，補腎化痰組 0.94 g/kg，利維愛組 0.23 mg/kg[7]，阿托伐他汀組0.92 mg/kg灌胃給藥，模型組和假手術組灌以2 mL生理鹽水，每日1次，連續給藥8周。定期喂食及更換墊料，保持環境清潔干凈。

1.2.2 標本采集及生化檢測 最后1次灌胃后，禁食24 h，用水合氯醛腹腔麻醉處死，采集右心室新鮮血液。將收集的血液置于抗凝管中，于4℃凍存待用。分離大鼠股骨、脛骨周圍軟組織，將骨組織置于EP管中，存入-80℃冰箱中備用。全自動生化儀測定血清脂代謝指標，ELISA測定血清Leptin、E2濃度，在450nm波長下用酶標儀測量各孔光密度（A值），繪制標準曲線，計算實際濃度。

1.2.3 Micro-CT檢測骨密度 取出凍存的新鮮標本右側股骨，使用比利時產skyscan 1176型顯微骨密度檢測儀掃描右側股骨遠端測定骨量。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測觀察Leptin mRNA、β2-AR mRNA 將新鮮冰凍骨組織加入1mL Trizol試劑，用勻漿器研磨成漿，經裂解、洗滌、沉淀后提取RNA，然后進行逆轉錄cDNA，逆轉錄反應體系為20μL，反應條件為：25℃5min，50℃15min，85℃5 min，4℃10 min，循環1次，對cDNA模板進行擴增（擴增引物見表1）。擴增后進行實時熒光定量PCR檢測，反應體系（共20μL）為：cDNA 4μL，Forward Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，SYBR Green Mix 10μL，H2O 5.2μL。PCR 反應條件：95℃預變性 10 min；95℃變性30 s，60℃ 退火 30 s，循環40次。繪制溶解曲線，以β-actin的mRNA為參照，用 2-ΔΔCT計算 Leptin mRNA、β2-AR mRNA 的相對表達量。

1.3 統計學處理 運用SPSS23.0進行分析，實驗結果以均數±標準差（x±s）表示，組間兩兩比較采用S-N-K檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠基本情況觀察 大鼠造模完成3 h后蘇醒，可正常飲水進食。24 h后觀察傷口無滲出紅腫，能自由活動，72 h后傷口好轉，無感染跡象。1周后大鼠傷口痊愈，縫線掉落。實驗灌胃過程中，模型組有1只死亡，補腎化痰組有2只死亡，3只大鼠均因藥液插入氣管窒息死亡。

表1 PCR測量Leptin、β2-AR的引物序列Tab.1 PCR measurement of primer sequencesfor Leptin andβ2-AR

2.2 各組大鼠的骨密度（BMD）及血清指標 與假手術組比較，模型組的BMD降低（P＜0.05），說明去勢骨質疏松癥模型建立成功。治療8周后，與假手術組比較，利維愛組、阿托伐他汀組及補腎化痰組的BMD升高（P＜0.05），說明補腎化痰方、利維愛、阿托伐他汀均具有提高去勢骨質疏松大鼠的BMD、減少骨流失的作用。與假手術組比較，模型組、利維愛組、阿托伐他汀組、補腎化痰組中血清Leptin、E2含量降低（P＜0.05）；與模型組比較，利維愛組、阿托伐他汀組、補腎化痰組中血清Leptin、E2含量升高（P＜0.05），補腎化痰組升高E2濃度優于利維愛組，但補腎化痰組、利維愛組、阿托伐他汀組3組間比較無統計學差異（P＞0.05）。見表 2。

表2 各組大鼠的骨密度及血清指標結果（x±s）Tab.2 Resultsof bone mineral density and serum indexes of rats in each group（x±s）

2.3 各組大鼠脂代謝指標 全自動生化儀檢測結果顯示，與假手術組比較，模型組、利維愛組、阿托伐他汀組、補腎化痰組TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，利維愛組、阿托伐他汀組、補腎化痰組TC、TG、LDL-C水平下降，HDL-C水平升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與阿托伐他汀組比較，補腎化痰方調節脂代謝水平低于阿托伐他汀組，但差異無統學意義（P＞0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠骨組織中Leptin mRNA與β2-AR mRNA的表達 各組大鼠股骨中Leptin mRNA和β2-AR mRNA的表達見表4。與假手術組比較，模型組、利維愛組、阿托伐他汀組、補腎化痰組大鼠Leptin mRNA相對表達量降低，β2-ARmRNA相對表達量增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，利維愛組、阿托伐他汀組、補腎化痰組大鼠Leptin mRNA相對表達量顯著增加，β2-AR mRNA相對表達量顯著降低，且差異具有統計學意義（P＜0.05）；補腎化痰組Leptin mRNA相對表達量高于阿托伐他汀組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠脂代謝指標結果（x±s）Tab.3 Resultsof the lipid metabolism index of ratsin each group（x±s）mmol/L

表4 各組大鼠骨組織中Leptin mRNA與β2-AR mRNA的表達（x±s）Tab.4 Expression of Leptin mRNA andβ2-AR mRNA in bonetissue of rats in each group（x±s）

3 討論

絕經后骨質疏松癥多與雌激素水平下降有關，中醫將其歸屬于“骨痿”“骨痹”等范疇，其病機多責之于腎，故一直以來補腎作為中醫防治絕經后骨質疏松癥的主要研究方向[8-9]。脂代謝紊亂是中醫“痰濁”的物質基礎，研究者發現脂代謝紊亂與絕經后骨質疏松也存在密切的關系[10]。因此，筆者的導師向楠教授根據自己的臨床觀察，結合現代研究以及中醫基礎理論知識，提出了“痰濁也是導致絕經后骨質疏松癥的重要致病因素”，制定了補腎化痰新治則，并融合《本草綱目》補骨脂丸與《丹溪心法》黃瓜蔞丸加減而成補腎化痰方，在補腎的基礎上，從“痰”論治絕經后骨質疏松癥[11]。

西醫治療絕經后骨質疏松癥會予以補充雌激素，但長期使用會增加患腫瘤風險[12]，限制了臨床的推廣應用，故探索中醫藥防治絕經后骨質疏松癥成為新的熱點。本課題組研究的補腎化痰方為向楠教授臨床使用的基礎處方，該方由6味中藥組成，菟絲子為君藥，滋補肝腎、固精壯骨，淫羊藿、補骨脂兩藥相合共助菟絲子補腎填精、強腰壯骨之功，全瓜蔞清熱化痰，山楂善于消食化積，紅曲長于健脾消食。全方共奏補腎化痰，強精壯骨之功。藥理學研究發現，菟絲子、淫羊藿、補骨脂具有類雌激素樣作用及抗骨質疏松作用[13-14]。全瓜蔞、山楂、紅曲具有促進脂代謝、降糖降脂、調節免疫等藥理作用[15-17]。前期研究中發現補腎化痰方可促進骨髓間充質干細胞成骨分化，抑制其成脂分化，影響鈣磷代謝，促進骨礦化，防治骨質疏松癥[18-20]。本次實驗在前期研究基礎上進一步探索補腎化痰方通過影響Leptin介導的交感神經系統β2-AR的表達水平來防治絕經后骨質疏松癥的機制。

前期實驗分組發現補腎化痰方低、高劑量組對BMD及相關檢測指標差異無統計學意義[7]，故本次研究中未按照濃度依賴性進行分組。利維愛可降低TC及TG，防止脂質沉積，同時補充雌激素，在防治絕經后骨質疏松癥療效顯著[21-22]。臨床研究發現阿托伐他汀在調節脂代謝的同時可以有效改善患者骨密度水平[23]，且有實驗表明他汀類藥物對骨骼具有積極的生物學效應，能改善骨微結構，增加骨量，促進骨形成[24]。故本次實驗以利維愛和阿托伐他汀為陽性對照組，探討補腎化痰方在調節脂骨代謝方面的療效。

Leptin是一種由白色脂肪組織分泌的蛋白質類激素，骨髓腔中的脂肪組織也可分泌產生[25]，可誘導脂類水解。Leptin在調節骨代謝方面也發揮著日益重要的作用，它主要通過中樞下丘腦-交感神經-β受體途徑和外周骨髓基質細胞兩種途徑進行調節[26]。研究發現，Leptin可增加骨密度并對骨組織具有保護作用，其作用機制與雌激素類似[27]。本次實驗結果顯示，補腎化痰方能夠增加去勢骨質疏松大鼠的骨密度，提高血清中Leptin、E2含量，調節脂代謝水平，增加骨組織中Leptin mRNA水平，可減少骨丟失，防治絕經后骨質疏松癥。但本次實驗中發現補腎化痰組與利維愛組、阿托伐他汀組差異無統計學意義，認為補腎化痰方可同時發揮補充雌激素，調節脂代謝水平的作用，有效治療絕經后骨質疏松癥。

交感神經系統廣泛存在于人體的組織器官中，骨和骨膜分布較為豐富，發揮著生物學效應，對骨的調節主要是通過交感神經系統β2腎上腺素能受體來抑制骨形成[26]。Fateme等[28]通過對100多篇文章的回顧性分析總結出交感神經系統的腎上腺素能活性是骨量的負性調節因子。與此同時，交感神經系統也是Leptin中樞調控骨形成的下游媒介，Leptin通過作用于成骨細胞的β2-AR，抑制成骨細胞的增生，降低骨量，最終引起絕經后骨質疏松癥的發生[29]。本次結果顯示，補腎化痰方能夠通過Leptin mRNA的表達水平，來抑制β2-ARmRNA的水平表達，抑制交感神經系統的活性，促進成骨細胞的增殖分化，增加骨量。

因此，通過本次實驗研究可以推測出補腎化痰方通過激活Leptin及β2-AR途徑，進而補充雌激素，調節脂代謝，促進成骨分化，抑制成脂分化，來防治絕經后骨質疏松癥，這是可能的作用機制之一，但是目前只是從實驗中得出的推斷結論，對于補腎化痰方防治絕經后骨質疏松癥的具體機制及臨床研究還有待進一步深入探索。