溫度對白菜廢棄物青貯發酵品質的影響及微生物多樣性分析

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(1.蘭州理工大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730050;2.甘肅省生物質能與太陽能互補供能系統重點實驗室,甘肅蘭州 730050;3.西北低碳城鎮支撐技術協同創新中心,甘肅蘭州 730050;4.蘭州理工大學西部能源與環境研究中心,甘肅蘭州 730050)

中國是蔬菜種植、生產和消費大國,國家統計局數據顯示，2017年我國蔬菜播種面積約1998.1萬公頃,產量約80000萬噸,其中白菜產量約11416萬噸。隨著蔬菜的商業化流通及人們對蔬菜質量要求的提升,每年約有30%的尾菜(蔬菜根、莖、葉、盤等)被廢棄或填埋,造成嚴重的環境污染和資源浪費,尾菜處理已成為蔬菜產業可持續發展的瓶頸[1]。目前,有關尾菜利用的報道多集中于肥料(直接還田、堆漚[2])、生物能源(厭氧發酵制沼氣[3])和青貯飼料[4]等方面,尾菜直接飼喂蚯蚓、黃粉蟲等也有實際應用案例。但因尾菜具有含濕量高、易降解等特點,實際生產中常出現尾菜尚未及時處理就腐敗變質的現象;而且季節性強、量大集中爆發式產出也限制了尾菜的處理效率。另外,一年四季的蔬菜種植導致尾菜全年都有產生,勢必需要能周年、不間斷、及時消納處理。蘭州地區獨特的生態氣候孕育了品種繁多、品質優異的“高原夏菜”,梯次播種確保了蔬菜能夠周年供給,但也面臨著不同季節的尾菜處理難題。

青貯是將青綠植物類生物質密封貯存于厭氧環境進行固態發酵,利用原料附著微生物將可溶性碳水化合物轉化為有機酸,進而降低pH,從而抑制腐敗微生物生長繁殖,達到保質貯存之目的[5]。Ahmadi等[6]研究表明,添加焦亞硫酸鈉對果蔬廢棄物長時間厭氧保存有積極作用。Cao等[7]發現,添加乳酸菌和甜菜粕能顯著改善生菜、甘藍菜和大白菜等尾菜的青貯品質。Okubo等[8]認為,添加馬鈴薯濃縮蛋白能有效提升胡蘿卜、甘藍菜葉等尾菜的粗蛋白含量和干物質消化率。Yang等[9]發現甘藍菜、白菜和萵筍葉等尾菜在高水分狀態下(94.2%～97.1%)青貯60 d后具有較高乳酸含量(14.8%DM～24.8%DM)和較低pH(3.6～3.9),貯存品質良好。周苗苗等[10]認為花椰菜莖葉在60%～70%水分含量條件下發酵60 d的青貯品質良好。可見,青貯不僅能及時、低成本處理尾菜,緩解腐敗變質引發的土壤、空氣等污染問題,還能保存營養物質,實現飼料化應用。但由于尾菜資源量較為龐大,青貯必須高效快速,混合青貯或添加劑青貯能夠延長作業時間,降低處理效率。另外,貯存溫度、密度、添加劑、干物質和營養物質含量等因素也會影響青貯品質[11]。因此,研究探索不同季節溫度下尾菜的青貯品質差異性和可行性尤為必要,但目前尚未見這方面的文獻報道。

鑒于此,本文為了解高水分尾菜在不同季節氣候溫度下的青貯可行性,提高尾菜及時轉化處理利用率,以白菜廢棄物為原料,模擬蘭州地區不同季節的氣候溫度,考察了不同溫度對尾菜青貯發酵過程中感官質量、有機組分、發酵特性的影響,并結合高通量測序技術解析微生物菌群多樣性,探索不同溫度下微生物菌群與尾菜青貯品質之間的關系,以期為實現尾菜資源的青貯利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白菜(Brassicapekinensis(Lour.)Rupr.)廢棄物 收集自學校附近菜市場,含水量為94.82%,可溶性碳水化合物含量為14.57%(以干基計);Water DNA Isolation Kit DNA試劑盒 成都福際生物技術有限公司;蒽酮等試劑 分析純,天津市大茂化學試劑廠。

SBA-40X生物傳感器 山東省科學院生物研究所;UB-7型pH計 北京丹佛儀器有限公司;F800全自動纖維分析儀測定 山東海能科學儀器有限公司;GC9790Ⅱ氣相色譜儀 浙江富力電子科技有限公司;752N紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;K9840自動凱氏定氮儀 山東海能科學儀器有限公司;PH-070A干燥箱/培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;TG16臺式離心機 長沙英泰儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 青貯試驗設計與樣品處理

1.2.1.1 試驗設計 將收集的白菜廢棄物切碎至2 cm×2 cm后裝填、壓實、密封于青貯容器中,貯存密度為600 kg/m3,模擬蘭州地區氣候條件,設置低溫((-3±1) ℃,代表冬季室外均溫,OA組)、中溫((18±1) ℃,代表初春深秋季節均溫,RA組)和高溫((34±1) ℃,代表夏秋高溫季節均溫,HA組)3個處理,每組3個平行,連續青貯30 d后進行分析。原料對照組命名為IA。

1.2.1.2 取樣及預處理 按照四分法稱取3份有代表性的樣品各20 g,第一份取樣打漿后經4層紗布(18目)過濾,然后3900 r/min離心10 min得到上層液,再經抽濾獲得浸提液,測定pH后于-20 ℃凍存,用于測定乳酸(Lactic acid,LA)、乙酸(Acetic acid,AA)、丙酸(Propionic acid,PPA)、丁酸(Butyric acid,BA)、乙醇(Ethanol,EA)和氨氮(Ammonia nitrogen,AN)等微生物代謝產物。另一份樣品經105 ℃烘干至恒重后,粉碎過40目篩,用于測定干物質(Dry matter,DM)、可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrate,WSC)、粗蛋白(Crude protein,CP)、以及酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)、中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗滌木質素(Acid detergent lignin,ADL)等有機組分。第三份樣品與200 mL無菌水混合,37 ℃恒溫振蕩2 h制得菌懸液,用0.22 μm無菌濾膜過濾得微生物菌體[12]。將整張帶有菌體的濾膜剪碎后置于2 mL無菌離心管中提取總DNA,經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Illumina Miseq測序。

1.2.2 感官質量評價 參考德國農業協會青貯質量感官評價標準,從色澤、氣味和質地角度綜合評定,評分結果分為優等(16～20)、尚好(10～15)、中等(5～9)和腐敗(0～4)4個等級[13]。

1.2.3 干物質和營養組分含量的測定 DM采用105 ℃烘干恒重法,烘干時長48 h,WSC測定采用蒽酮-硫酸比色法[14],CP測定使用K9840半自動凱氏定氮儀[15]。

1.2.4 木質纖維組分含量的測定 NDF、ADF和ADL含量采用F800纖維測定儀,纖維素(Cellulose CL)、半纖維素(Hemicellulose HC)和綜纖維素(Holocellulose HoC)含量由公式CL=ADF-ADL、HC=NDF-ADF、HoC=CL+HC計算得出[15]。

1.2.5 發酵特性的測定

1.2.5.1 pH測定 pH用UB-7型pH計測定。

1.2.5.2 氨氮與總氮測定 氨氮采用苯酚-次氯酸比色法測定[16];總氮用K9840半自動凱氏定氮儀測定[15]。

1.2.5.3 有機酸含量測定 乳酸和乙醇用SBA-40X生物傳感器測定;乙酸、丙酸和丁酸等有機酸采用GC9790II氣相色譜儀測定,將樣品用6 mol/L的濃硫酸酸化至pH為3以下,再滴加數滴甲酸將pH調節至2左右,然后用自動進樣器進樣。分析采用FID檢測器,FFAP型號毛細管色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm);進樣器溫度250 ℃;柱箱溫度80～200 ℃,程序升溫8 min;FID檢測器溫度250 ℃,樣品停留時間為5 min;載氣為N2和H2,分流比1∶100;進樣量為1 μL。總有機酸(Total organic acid)為乳酸、乙酸、丙酸和丁酸等小分子有機酸之和[15]。

1.2.6 細菌多樣性分析 細菌群落的高通量測序選擇擴增區域16S r DNAv3-v4,設計正反向加上transposase sequences的引物,擴增得到帶transposase sequences的PCR產物片段。PCR擴增條件為:95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s 25個循環;72 ℃ 10 min。目的PCR產物用0.8倍體積AMPure XP Beads 純化后,用P5+index i5和P7+index i7引物進行第二輪擴增,得到的PCR產物即帶有P5/P7接頭序列和雙端index。第二輪PCR產物用1倍體積AMPure XP Beads純化后,用Qubit ds DNA HS assay kit(Invitrogen,美國)進行熒光定量(Qubit 2.0 Fluorometer),多個樣本等量混合成測序pool。PCR擴增條件為:95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,8個循環;72 ℃ 10 min。取10 ng的測序pool,用MiSeq Reagent Kit v3在Illumina MiSeq中進行雙向測序,得到2×300 bp的數據。下機數據預處理后進行生物信息學分析、多樣性分析和物種組成分析。選定相對豐度高于0.1%細菌群落制作菌群微生態分布圖,并從門、屬水平解析微生物多樣性[17]。

1.3 數據分析

基礎數據利用Excel 2007軟件整理并制作圖表,利用SPSS 18.0軟件進行了方差分析(ANOVA),并用Duncan方法對數據進行檢驗,以分析不同處理之間的差異。以平均值±標準差表示測定結果,P<0.05代表數據存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 溫度對青貯發酵感官質量的影響

由表1可知,青貯發酵30 d后,低溫OA組和中溫RA組的感官質量均為優良,有明顯芳香味,廢棄白菜的物理結構保持良好,外觀呈淡黃色;高溫HA組的顏色變為淡褐色,且芳香味較弱,感官等級為尚好。但由于感官評價不確定因素較多,需結合組分分析和發酵特性分析對青貯品質進行綜合評判。

表1 不同溫度處理組的感官質量評分Table 1 Sensory quality scores of different temperature treatments groups

2.2 溫度對干物質和營養組分含量的影響

可溶性碳水化合物(WSC)和粗蛋白(CP)等營養物質能給乳酸菌等菌群發酵提供能量,溫度通過影響微生物對營養物質的代謝速率來調控干物質(DM)和有機組分含量的消長變化。由表2可知,與原料相比,青貯30 d后OA組與RA組的DM含量顯著升高(P<0.05);且30 d時OA組的DM含量顯著高于RA組和HA組,但后兩者之間差異不顯著(P<0.05)。同時,DM含量隨溫度升高呈下降趨勢。這可能是因為青貯過程中乳酸菌、腸細菌和梭菌的最適溫度為37 ℃左右,這些微生物的活性在低于最適溫度時會隨溫度升高而增強,加快了營養物質的分解[18-19]。

WSC可直接被乳酸菌利用并產生有機酸,適宜的WSC含量有助于獲得優良青貯品質。和對照(0 d)相比,30 d時3個處理組的WSC含量均顯著下降(P<0.05);且隨著溫度的升高,WSC含量呈先下降后上升趨勢,OA組中WSC含量顯著高于RA和HA組(P<0.05),HA組顯著高于RA組(P<0.05)。這是因為溫度不同會導致微生物菌群的活性存在差異,從而產生不同的WSC消耗速率;低溫時微生物活動微弱,使WSC含量保存較好。另一方面,蛋白質在植物或微生物蛋白酶的作用下會發生降解,溫度會影響微生物及酶活性,進而使蛋白質分解速率產生差異[18]。和對照(0 d)相比,青貯發酵30 d時3個處理組CP含量均顯著下降(P<0.05),并隨溫度升高呈現先升高后下降趨勢,RA組中CP含量顯著高于OA和HA組(P<0.05),OA組和HA組之間無顯著性差異(P>0.05)。可見,中溫(18±1) ℃條件有助于乳酸菌等有益微生物利用WSC繁殖代謝,并能更好地保存蛋白組分。

表2 不同溫度處理對干物質和營養組分含量的影響Table 2 Effect of different temperature treatment on the content of dry matter and nutrient components

注:同列不同大寫字母表示相同處理組不同時間差異顯著(P<0.05),同列不同小寫字母表示相同時間不同處理組差異顯著(P<0.05)；表3、表4同。

表3 不同溫度處理對木質纖維組分含量的影響(g/100 g DW)Table 3 Effect of different temperatures on the content of lignocellulosic components(g/100 g DW)

2.3 溫度對木質纖維組分含量的影響

木質纖維含量的高低是影響青貯飼料消化率的首要因素[20]。酸性洗滌纖維(ADF)含量越低,飼用價值越高;中性洗滌纖維(NDF)含量越高,會使飼料消化率降低,從而降低青貯品質。另一方面,木質素、纖維素(CL)和半纖維素(HC)三種組分相互包裹、纏繞構成復雜的木質纖維網絡結構,也會影響動物攝入后在體內的消化降解性能[21]。

如表3所示,青貯發酵30 d時,3個處理組中的木質纖維組分含量發生了明顯變化。與原料相比,低溫OA組中ADF和NDF含量顯著增加(P<0.05),RA組中ADF和NDF含量顯著下降(P<0.05),而HA組中ADF和NDF含量無顯著變化(P>0.05)。3個處理組的酸性洗滌木質素(ADL)含量均顯著低于原料(P<0.05),從而使CL和HoC含量顯著增加(P<0.05)。從溫度影響角度來看,OA組中ADF、CL和HoC含量顯著高于RA組和HA組(P<0.05),且RA組中這三種組分顯著低于HA組(P<0.05)。說明低溫和高溫青貯發酵時的纖維含量相對較高,中溫有助于減少纖維含量,提高飼用價值。

2.4 溫度對青貯發酵特性的影響

2.4.1 pH和氨氮/總氮的變化 青貯過程中對pH變化起決定作用的是乳酸菌等有益菌群,而溫度會通過影響乳酸菌繁殖代謝活性來影響青貯品質,溫度過低或過高都不利于乳酸菌生長[22]。優良青貯的pH范圍一般為3.7～4.2。如圖1所示,發酵30 d時3個處理組的pH均低于4.2,且隨溫度的升高呈現先上升后下降的趨勢,RA組的pH顯著高于OA組和HA組(P<0.05),達到3.95。

氨氮/總氮(AN/TN)也是評價青貯發酵品質優劣的重要指標。氨氮主要由植物酶和梭狀芽孢桿菌等微生物分解蛋白質和氨基酸所產生,AN/TN比值越大,發酵品質就越差。優質青貯的AN/TN一般低于10%[23]。試驗中,3個處理組的AN/TN均低于5%,其中RA組和HA組的AN/TN顯著高于OA組(P<0.05),但RA組與HA組之間差異不顯著(P>0.05)。因為中高溫條件有助于蛋白分解酶活性釋放和梭菌等有害微生物繁殖,蛋白質分解相對活躍,進而加劇干物質損失,這與表2中DM變化趨勢相吻合[24]。

圖1 溫度對青貯過程中氨氮/總氮(AN/TN)和pH的影響Fig.1 Effect of temperature on ammonia nitrogen/total nitrogen(AN/TN)and pH during silage注:不同的大寫字母表示相同時間 不同處理組差異顯著(P<0.05)。

2.4.2 發酵中間產物的變化 有機酸和乙醇是青貯發酵過程中微生物菌群的中間代謝產物,乳酸通常是由乳酸菌利用水溶性糖代謝產生;乙酸是乙酸菌將乙醇轉變為乙酸,以及異型乳酸菌分解碳水化合物所致,具有真菌抑制功效;丙酸通常由梭菌及丙酸菌生成;丁酸是由梭菌作用于乳酸和碳水化合物而生成;乙醇是異型發酵乳酸菌和耐酸酵母菌所產生[25-26]。由表4可知,3個處理組的乳酸含量隨溫度升高而顯著下降(P<0.05),乙酸含量則均呈現先升高后下降趨勢;RA組的乙酸含量顯著高于其他兩組(P<0.05),丙酸和丁酸含量均低于0.1%,符合優良青貯標準。乙醇含量隨溫度升高呈現先下降后上升的趨勢,RA組的乙醇含量顯著低于OA組和HA組(P<0.05)。上述小分子有機酸和醇類物質的聯動變化,使乳酸發酵強度隨溫度升高而下降,這一點從LA/AA和LA/TOA變化趨勢可得到印證。

表4 溫度對青貯過程中微生物發酵中間產物的影響(%)Table 4 Effect of temperature on microbial fermentation intermediates during ensiling(%)

2.5 不同溫度下青貯發酵過程中的細菌群落多樣性

2.5.1 原始數據處理 在序列充足前提下,為提高分析結果質量,先對原始數據進行過濾處理,得到優質序列。優質序列是有效測序序列中含有特異性擴增引物、不含模糊堿基、長度大于可供分析標準的序列。圖2結果顯示,3個處理組的優質序列均在20000條以上;三種溫度時青貯發酵后的優勢序列均高于原料,其中RA組的優勢序列最多為36622,為數據分析提供充足的信息來源。同樣,發酵后的OTUs數量也有明顯提高,但HA組與原料差別不大。OTUs代表了物種豐度,由于高溫HA條件與乳酸菌等有益微生物的最適繁殖溫度范圍接近,故使得乳酸菌群大量繁殖并對其他有害微生物造成競爭性抑制,使物種豐富程度有所下降[27]。

圖2 不同處理組優質序列數及OTUs數量統計Fig.2 Statistics of high-quality sequence and OTUs quantity in different treatment groups

2.5.2 OTUs聚類分析 OTUs(Operational taxonomic units)是在系統發生學或群體遺傳學研究中,為分析方便,人為給某一個分類單元(品系、屬、種、分組等)設置的同一標志,OTUs數量亦代表物種豐度[28]。OTUs分布的Venn圖能統計多個樣本中所共有和獨有的OTUs數目,直觀表現樣本OTUs數目組成的相似性及重疊情況。

如圖2和圖3所示,IA、OA、RA、HA三組OTUs分別為67、84、87、66。OA組與RA組的OTU數量較原料有明顯增加,HA組豐度較原料有所降低,不同樣品所含OTUs數量依序為RA>OA>IA>HA,說明中溫青貯時微生物類群最為豐富。其中,發酵后三個處理組共有的OTUs數量為49個,并且與原料相比,三個處理組都有其獨有的OTUs,特別是OA組中獨有的OTUs能夠占到其全部OTUs的46.4%,說明不同溫度下青貯樣品的物種多樣性存在有一樣的微生物類群,但受到溫度不同的影響而產生了獨特的群落差異[29]。

圖3 維恩圖Fig.3 Venn diagram

2.5.3 稀釋曲線 稀釋曲線可直接反映測序數據量的合理性,并間接反映樣品的物種豐富度。從稀釋曲線(圖4)來看,樣本測序數據量為24492,隨著測序數量的增加,稀釋曲線斜率逐漸降低,趨向平坦但未進入平臺期,但更多的數據量只會產生少量新的OTUs,因此本次測序結果較為準確合理[12]。由圖4還可知,高溫HA組的數量最低,中溫RA組數量最高,說明中溫青貯發酵時的微生物豐富度較好,這與圖2和圖3中結果信息相吻合。

圖4 稀釋性曲線Fig.4 Dilution curve

2.5.4 Alpha多樣性 表達Alpha多樣性的Coverage、Chao、Ace和Shannon等指數分別用于評估物種的測序深度、豐度和多樣性。Coverage指數能反映樣本真實情況,數值越高,則樣本中序列未被測出的概率越低;Chao和Ace指數屬于群落豐度指數,數值越大,表明微生物群落豐度越高;Shannon和Simpson指數用來估算微生物多樣性,Shannon指數越大、Simpson指數越低,表明樣品微生物多樣性越高[29]。如表5所示,與原料相比,3個青貯處理組的Chao指數和Ace指數均有所增加,說明發酵后的微生物群落豐富度均有所升高。另一方面,OA組的Shannon指數上升,Simpson指數下降,說明OA組的微生物多樣性處優勢地位。所有樣品的Coverage數值都較大,說明結果可以代表樣本微生物群落的真實情況。

2.5.5 基于PCA的群落結構分析 PCA分析是一種對數據進行簡化分析的技術。通過分析不同樣本OTU(97%相似性)組成可以反映樣本間的差異,如樣本組成越相似,反映在PCA圖中的距離越近[12]。如圖5所示,每個點分別代表了一個樣品,主成分分析共提取了3個主成分,其中第一主成分PC1和第二主成分PC2貢獻率分別為48.80%和21.24%,累計貢獻率達到了70.04%,可以解釋變量的絕大部分信息。原料IA組與青貯發酵后3個處理組樣品的距離均比較遠,說明發酵前后樣品的微生物群落有明顯變化;RA組與HA組距離較近,說明二者相似性較高。

圖5 原料和不同處理組的主成分分析(PCA)Fig.5 Principal component analysis(PCA) for raw material and different treatments

2.5.6 多樣本相似度樹狀圖 多樣本相似度樹狀圖利用樹枝結構描述和比較多個樣本間的相似性和差異關系。如圖6所示,4組數據可分為兩大類,其IA單獨為一個分支,與其他樣品的群落組成差異性較大;RA、OA與HA均在第二分支上,說明其趨同性較高。

圖6 原料和不同處理組的多樣本相似度樹狀圖Fig.6 Multi-sample similarity tree for raw material and different treatments

2.5.7 門分類水平細菌群落組成 由圖7可知,原料IA組的門水平優勢菌為變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes),豐度分別為80.23%和18.57%。青貯發酵后細菌群落主要演變為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和藍藻(Cyanobacteria)等。其中OA組的門水平優勢菌主要有變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes),豐度分別為47.19%和49.01%,RA組中的變形菌門(Proteobacteria)豐度降為12.07%,厚壁菌門(Firmicutes)豐度增至87.27%,HA組的變形菌門(Proteobacteria)豐度降至16.67%,而厚壁菌門(Firmicutes)的菌群豐度為82.39%,說明中高溫青貯時厚壁菌門(Firmicutes)門細菌占主導優勢。

變形菌門(Proteobacteria)是革蘭氏陰性菌,包括大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌[30],它們會與乳酸菌競爭性利用WSC,并造成CP含量下降和氨氮含量升高。厚壁菌門(Firmicutes)是低GC含量的革蘭氏陽性菌,主要有產芽孢、非產芽孢和支原體菌群,可以降解很多大分子化合物,如淀粉、蛋白質和纖維素等[31]。發酵后變形菌門(Proteobacteria)豐度的降低和厚壁菌門(Firmicutes)豐度的升高使青貯料中的CP、NDF和ADF含量均有下降趨勢,這與表3中結果一致。可見,厚壁菌門是引起粗蛋白和纖維素等有機組分變化的主要因素。

圖7 門分類水平上的細菌群落組成Fig.7 Bacterial community composition at the Phylum level

2.5.8 屬分類水平細菌群落組成 屬水平細菌群落組成如圖8所示。原料IA附著的細菌主要包括假單胞菌屬(Pseudomonas)、泛菌屬(Pantoea)、黃桿菌屬(Flavobacterium)和腸桿菌屬(Enterobacter)等,其中優勢菌假單胞菌屬(Pseudomonas)豐度最高為48.40%。低溫發酵后OA組中的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)豐度為28.43%,耶爾森氏鼠疫桿菌(Yersnia)和腸桿菌屬(Enterobacter)豐度次之,分別為19.50%和17.13%,此外還有少量明串珠菌屬(Leuconostoc,11.02%)、泛菌屬(Pantoea,8.62%)和乳球菌屬(Lactococcus,5.73%)等。中溫RA組和高溫HA組的細菌群落構成類似,優勢菌都演變為乳酸桿菌屬(Lactobacillus),豐度分別高達80.07%和74.63%。另外,RA組中的腸桿菌屬(Enterobacter)豐度為8.62%,明串珠菌屬(Leuconostoc)豐度為6.19%,泛菌屬(Pantoea)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和黃桿菌屬(Flavobacterium)等細菌豐度均低于1%;HA組中腸桿菌屬(Enterobacter)、明串珠菌屬(Leuconostoc)和耶爾森氏鼠疫桿菌(Yersnia)豐度分別為11.24%、5.98%和4.37%。另一方面,OA組中演繹生成乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳球菌屬(Lactococcus)、魏斯式菌屬(weissella)、腸球菌屬(Enterococcus)、肉桿菌屬(Carnobacterium)等乳酸細菌的總豐度之和僅為48.92%,腸桿菌屬(Enterobacter)和耶爾森氏鼠疫桿菌(Yersnia)等腐敗菌豐度較高達到36.63%,而RA組和HA組的乳酸菌屬豐度之和分別高達87.14%和82.29%,使腸桿菌屬(Enterobacter)等有害微生物被有效抑制。從乳酸細菌多樣性來看,廢棄白菜青貯發酵后的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)比重均有明顯增加,并占據主導地位。這與Yan和劉晶晶等[27,32]報道的柳枝稷、黑麥草青貯發酵時乳酸桿菌屬(Lactobacillus)為優勢菌群結果一致。

圖8 屬分類水平上的細菌群落組成Fig.8 Bacterial community composition at the genus level

總體來看,原料青貯前自身表面附著的乳酸菌群較少,生長繁殖緩慢,并與其他微生物存在競爭性抑制。一旦進入青貯發酵,乳酸菌等有益菌不斷繁殖進而產生乳酸等有機酸從而降低pH,抑制其他腐敗微生物生長,并且隨著溫度升高,有利于提升青貯品質的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)逐漸演變為優勢菌群。結合圖5和圖6結果綜合判斷,青貯發酵溫度的不同導致了微生物菌群種類及其豐度不斷發生變化。

3 結論

廢棄白菜青貯發酵30 d時能獲得良好的感官質量,得益于乳酸菌群的發酵代謝。青貯過程中,乳酸菌等有益菌利用可溶性碳水化合物繁殖代謝產生乳酸和乙酸等有機酸,從而保存粗蛋白等營養物質。中溫青貯30 d時的粗蛋白被有效保存,含量達到18.04 g/100 g DW,營養價值良好;酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量分別比原料減少了5.99 g/100 g DW和6.03 g/100 g DW,木質素含量減少了32.46 g/100 g DW,有助于提高動物飼喂過程中的降解消化性。另一方面,中溫(18±1) ℃青貯發酵有助于提升微生物豐富度和多樣性,使厚壁菌門(Firmicutes)的乳酸桿菌(Lactobacillus)在青貯發酵期間占據主導優勢,相對豐度高達80%以上,保證了廢棄白菜的良好青貯發酵。因此,建議生產中在中溫條件下進行廢棄白菜的青貯發酵,能獲得良好青貯品質。