基于生物熱力學的不同產地柴胡抑菌活性評價

趙艷丹,胡相卡,馬 悅,史淑丹,鄭 巖,邢炳權,劉雅茹,孫玉琦,代春美

(錦州醫科大學,遼寧錦州 121001)

柴胡為傘形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)或狹葉柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld.)的干燥根。現代藥理研究表明,柴胡具有解熱、抗菌、抗炎、保肝、抗病毒、抗腫瘤等作用,柴胡水提物對金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用[1-3]。柴胡皂苷(Saikosaponins,SS)是柴胡主要生物活性成分和化學指標,柴胡皂苷a和柴胡皂苷d是有效活性成分,為其重要的質量評價指標[4-6]。但是,中藥的指標成分不一定為有效成分,即使為有效成分,它的含量與藥效也不一定有直接聯系。檢測任何一種或幾種成分均不能反映其整體療效。

微量熱法為生物熱力學的主要研究手段之一,可測定生物機體在中藥材等作用下生長代謝過程的能量轉移和熱變化,通過獲得的熱力學信息,可以實時、連續、在線監測生物體的生長代謝情況及在藥材作用下的變化情況,從而表征藥材對生物機體的生長代謝影響。該方法具有靈敏、普適性好、準確、在線、實時、動態的特點,已在很多領域得到應用[7-10]。熱力學理論則反映了整體觀念,生物活性檢測與化學含量測定相比,具有更大的優勢。

金黃色葡萄球菌可引起人和動物的多種常見疾病,隨著抗生素類藥物治療細菌感染的廣泛應用,取得療效的同時,也帶來了耐藥性、過敏反應、毒性反應等諸多問題。為了克服這些弊端,世界各地的醫藥工作者漸漸地將研究重點轉向天然藥物,全球掀起了開發和研制天然藥物的浪潮[11]。本研究以金黃色葡萄球菌為測試菌,利用微量熱法,考察不同產地柴胡對金黃色葡萄球菌生長代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃色葡萄球菌CMCC(B)26001(批號26001-12a) 購自中國藥品生物制品檢定所;培養基:LB肉湯培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司;不同產地的9批S1-S9柴胡藥材 河北柴胡S1,山西柴胡S2-S5,陜西柴胡S6-S9;柴胡皂苷a對照品(批號110777-200507,純度為93.2%)、柴胡皂苷d對照品(批號110778-200505,純度為97.3%) 均購自中國藥品生物制品檢定所;乙腈、甲醇 色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司;氨水 分析純,洛陽大學化學試劑;正丁醇 分析純,山東旭晨化工試劑。

TAM Air微量熱儀 瑞典Thermometric公司;L-2130型高效液相色譜儀 日本日立公司;L-2455DAD型檢測器 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 柴胡的HPLC 測定

1.2.1.1 標準品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷a 10.36 mg和柴胡皂苷d 12.51 mg,置于25 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,得到含柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的混合標準品溶液,用HPLC測定標準品。

1.2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取柴胡樣品粉末(過四號篩)各10 g,8倍量水回流提取2次,每次1 h,合并提取液,濃縮,真空干燥得柴胡浸膏[12]。20 mL水溶解,飽和正丁醇萃取3次,每次60 mL,再用5%氨水洗2次,每次50 mL,分取飽和正丁醇液蒸干,甲醇溶解殘渣并定容至10 mL,搖勻,經0.45 μm微孔濾膜濾過,得柴胡供試品。

1.2.1.3 色譜條件 Hypersil BDS C18色譜柱(250 mm×46 mm,5 μm);以乙腈為流動相A,水為流動相B,按表1條件進行梯度洗脫;流速:1.0 mL/min,柱溫:30 ℃,檢測波長:210 nm[13]。

1.2.1.4 方法學考察 經考察,樣品的穩定性,儀器的精密度,方法的重復性良好,RSD小于2.0%,符合要求。分別取上述不同產地柴胡供試品溶液及標準品溶液各20 μL,注入高效液相色譜儀,記錄60 min內的色譜圖,以峰面積計算柴胡藥材中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.2.2 柴胡微量熱活性檢測

1.2.2.1 供試品溶液的制備 按照1.2.1.2項下供試品溶液制備所得浸膏,以滅菌三次蒸餾水為溶劑,配制成1 g/mL的溶液(以柴胡藥材計)。

1.2.2.2 微量熱活性的測定 在 37 ℃,測定金黃色葡萄球菌生長代謝熱譜曲線(空白對照組)。采用安瓿法,在凈化工作臺內,每個安瓿精確加入5 mL的LB培養基,接種金黃色葡萄球菌,菌接種量為1×106CFU/mL,加入一定量柴胡溶液,使各安瓿藥液終濃度為2 mg/mL,混勻,加蓋密封,放入微量熱儀中。37 ℃培養,記錄細菌的生長代謝曲線。

1.2.2.3 生物熱力學參數 金黃色葡萄球菌的生長時間曲線,P1、P2、T1和T2分別是兩個峰的最大功率和出峰時間,k是峰的最大生長速率常數,I為抑制率,tG為細菌傳代時間。

計算公式如下:Pt=P0exp(kt)或lnPt=lnP0kt,其中P0是時間t=0的熱流功率,Pt是時間t的熱流功率[14]。由 tG=(ln2)/k得出不同條件下的細菌傳代時間tG。細菌生長抑制率定義為 I=(k0-k1)/k0,式中k0為金黃色葡萄球菌在正常條件下的生長速率常數,k1為金黃色葡萄球菌在不同藥物作用下的生長速率常數。I值越大,藥物對細菌生長抑制作用越強。

1.2.2.4 色譜峰峰面積與抑制率I的相關性分析 為了進一步說明柴胡發揮抑菌作用的主要活性成分,本研究采用相關分析法,對9批次柴胡藥材的6個共有色譜峰峰面積與抑制率I進行Spearman雙變量相關分析[15-16]。

1.2.3 數據處理 實驗重復檢測3次,取其平均值。采用SPSS 20.0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同產地柴胡HPLC分析

2.1.1 不同產地柴胡樣品進行HPLC檢測的譜圖 根據1.2.1.3色譜條件,測定柴胡中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量,記錄60 min內的色譜圖。其標準品溶液譜圖見圖1(A)。確定了6個特征峰為共有色譜峰,見圖1(B)。

圖1 標準品溶液的HPLC色譜圖(A)、 柴胡樣品的HPLC共有色譜圖(B)Fig.1 HPLC chromatogram of standard solution(A), Common HPLC chromatogram of Bupleurum chinense(B)注:A為混合標準品,B為樣品的共有峰;1～6號峰為共有色譜峰,其中3號峰為 柴胡皂苷a,4號峰為柴胡皂苷d。

2.1.2 不同產地柴胡HPLC檢測共有峰的相對保留時間及相對峰面積 在柴胡的HPLC色譜圖中,由于4號峰分離度較好,峰面積較穩定,保留時間適中,且為柴胡主要藥理活性成分之一,故選定其作為參照峰,各共有峰的相對保留時間以及相對峰面積見表2～表3。

表2 不同產地柴胡HPLC圖譜共有峰相對保留時間Table 2 Relative retention time of common peak in HPLC chromatogram of Bupleurum chinensis from different habitats

表3 不同產地柴胡HPLC圖譜共有峰相對峰面積Table 3 Relative peak area of common peak in HPLC chromatogram of Bupleurum chinensis from different habitats

表4 柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量Table 4 Contents of saponins a,d in Bupleurum chinense

圖2 不同產地柴胡對金黃色葡萄球菌生長代謝產熱譜圖Fig.2 Power-time curve of Staphylococcus aureus in Bupleurum chinense from different habitats

2.1.3 不同產地柴胡HPLC含量測定 根據HPLC檢測的峰面積,計算柴胡中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量,其結果見表4。結果顯示,山西柴胡S3中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量最高,河北柴胡S1中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量最低,山西柴胡和陜西柴胡中柴胡皂苷a和d的含量高于河北柴胡。

2.2 柴胡提取物的生物活性測定結果

2.2.1 不同產地柴胡提取物作用于金黃色葡萄球菌生長代謝產熱譜圖 金黃色葡萄球菌在不同產地柴胡作用下的生長代謝產熱譜圖(圖2)。在相同的條件下,實驗結果有良好的重現性。各產地柴胡作用于金黃色葡萄球菌的譜圖形狀相似,相對空白對照組,各樣品最高峰的峰高、出峰的時間不同。

2.2.2 不同產地柴胡提取物作用于金黃色葡萄球菌生長代謝的熱動力學參數 由金黃色葡萄球菌的生長代謝產熱譜圖(圖2)獲得不同產地的柴胡作用于金黃色葡萄球菌的熱力學參數,如表5所示。與空白組相比,不同產地柴胡明顯降低了金黃色葡萄球菌生長的最大發熱功率P2,表明柴胡不同程度地抑制了細菌生長。抑制率I值反映了不同產地柴胡對金黃色葡萄球菌抑制作用的強弱。

表5 不同產地的柴胡作用于金黃色葡萄球菌的生長代謝熱力學參數Table 5 Thermokinetics parameters of Staphylococcus aureus growth in the presence of Bupleurum chinense from different habitats

結果發現,不同產地的柴胡抑制率在7.14%～53.06%,山西和陜西柴胡抑菌活性高于河北柴胡。其中山西柴胡S3對金黃色葡萄球菌的抑制率I為53.06%,其值最大,抑菌作用最強。由生長代謝曲線可以看出,不同產地的柴胡作用于金黃色葡萄球菌的曲線相似,峰形后移,傳代時間tG延長。說明生長代謝時間延長,也表明柴胡對金黃色葡萄球菌有抑制作用。其中,山西柴胡S3的傳代時間為150.68 min,其傳代時間最長,說明其對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強。

2.2.3 共有色譜峰峰面積與抑制率I的相關分析 采用SPSS軟件對共有色譜峰峰面積與生物熱力學參數抑制率I進行相關分析,其結果見表6。

表6 共有色譜峰峰面積與抑制率相關分析結果Table 6 Analysis results of correlation between peak area of common chromatographic peaks and inhibition rate

其中5個峰的相關系數R值均大于0.5,說明了這些成分與抑制率有較高的相關性。其中3號峰柴胡皂苷a的相關系數為0.783,4號峰柴胡皂苷d的相關系數為0.717,貢獻度較大,顯著相關(P<0.05)。說明柴胡皂苷a和柴胡皂苷d與柴胡抑制金黃色葡萄球菌活性存在著密切的關聯性。

3 討論與結論

現有中藥質量控制標準多為一個或幾個活性成分的指標,但單純的化學檢測無法反映各成分與藥效之間的關系。目前中藥質量差異較大,中藥藥效物質基礎研究思路傾向于藥材及有效部位,有效單體作用的“分離解析研究”,而疏于“還原-整合”思想,影響了中藥材的質量評價。以熱力學理論指導的生物活性測定與傳統化學成分測定相比,反映了中藥整體的效應[17]。

柴胡皂苷是柴胡主要化學指標和生物活性成份,根據其化學結構可分為柴胡皂苷a、b、c和d等,柴胡皂苷a、d活性最強,研究最廣。本研究以不同產地柴胡、柴胡皂苷為對象,基于生物熱力學活性對柴胡的抑菌作用進行了評價。結果表明柴胡皂苷含量最高的山西柴胡S3抑菌作用最強。進一步通過相關分析表明,柴胡皂苷a的峰面積與抑制率有最高的相關系數,說明柴胡皂苷a是其生物活性起作用的主要物質。其次,柴胡皂苷d相關系數僅次于柴胡皂苷a,對柴胡的生物活性也起著重要的作用。

本研究對不同產地柴胡的抑菌作用進行了研究與分析,用熱力學方法獲得主要熱動力學參數并與化學成分進行相關性分析。通過研究發現:將化學成分檢測與生物力學評價相結合,構建綜合的評控模式,有利于對藥材進行更合理的評控[18-19]。通過HPLC色譜峰峰面積與生物熱力學參數抑制率I的相關性研究,初步探討了柴胡的活性成分,同時也為柴胡的質量控制提供參考。微量熱法與傳統的化學檢測方法相比,體現了中藥作用的整體性。更客觀、全面地評價柴胡的生物質量,為中藥藥效物質篩選提供思路與參考,也為其它藥材的質量評價提供新思路。