ERIC-PCR及全自動核糖體分型法鑒定不同來源的解朊金黃桿菌

田 敏,馮 震3,曲瑞丹2,*,黃 靜,戚稼禹,曹 杰

(1.華東師范大學生命科學學院,上海 200241;2.上海城建職業學院健康與社會關懷學院,上海 201415;3.上海市食品藥品檢驗所,上海 201203)

蛋白質谷氨酰胺酶是一種新型的脫酰胺酶,能夠通過脫酰胺作用,增加蛋白質的負電荷,極大地改善蛋白質的溶解性、發泡性以及乳化性等功能特性。蛋白質谷氨酰胺酶特異性強,主要作用于大分子蛋白質,且不會引起蛋白質的水解以及蛋白質交聯等不良副反應,避免蛋白質結構破壞和風味的變化[1]。近年來,蛋白質谷氨酰胺酶倍受關注,但對其研究主要集中在結構、應用及安全性等方面[2-7],而對其產生菌株以及菌株多樣性的研究鮮見,且目前已報道的菌株產酶能力較低[8],不能滿足工業化生產的需求。

中國地域遼闊,資源豐富,本研究從采集自全國16個省、直轄市的799份土壤樣品中,篩選獲得206株具有產生蛋白質谷氨酰胺酶能力的菌株,并結合菌株形態特征、生理生化特征進行分型分析。在2007年,有學者[9]對產蛋白質谷氨酰胺酶的解朊金黃桿菌進行了致病性和毒性分析,結果表明該菌無致病性和毒性,可應用于食品工業。因而本研究將著重對其中的33株解朊金黃桿菌進行研究,了解其菌株之間的差異,分析其差異與其生存環境等之間的關系,為分離篩選高產的解朊金黃桿菌野生菌株提供有效的信息。

目前關于細菌分子分型方法較多,主要包括限制性核酸片段長度多態性(RFLP)[10]、隨機擴增多態性(RAPD)[11-13]、擴增片段長度多態性(AFLP)[14]、聚合酶鏈式反應和變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)[15]、腸桿菌重復性基因組常見一致序列(ERIC-PCR)[16-17]和RiboPrinter全自動核糖體RNA基因指紋圖譜分型[18-19]等多種技術。ERIC片段最初是在腸道菌基因組中發現的,長約124～127 bp,其中有一段長約40 bp的核心序列,根據其核心區域設計一對反向引物,因其引物較長(22 bp),所以較其他基于PCR的分子分型方法,可得到特異性和重復性更高的DNA指紋圖譜。全自動核糖體分型方法是杜邦公司研發的一款全自動細菌鑒定系統,該技術主要原理是細菌核糖體基因在進化中相對保守,通過使用限制性內切酶對菌株基因組進行消化,電泳轉膜,探針雜交,可得到一系列特異性高的指紋圖譜。

本研究結合ERIC-PCR分型和全自動核糖體分型兩種不同的方法對來自不同地理環境的解朊金黃桿菌進行多態性分析,分析菌株的差異與采樣環境以及菌株產酶能力之間的關聯,以期為高效篩選產蛋白質谷氨酰胺酶野生株提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

206株產蛋白質谷氨酰胺酶菌株 由華東師范大學微生物實驗室從采集自全國各地的799份新鮮土壤樣品分離獲得，其中的33株解朊金黃桿菌菌株基本信息見表1;胰蛋白胨 上海生物工程有限公司;酵母粉 OXOID;多聚蛋白胨 日本制藥株式會社;細菌基因組DNA抽提試劑盒 上海天根生化科技有限公司;瓊脂糖 上海生物工程有限公司;細菌16S rDNA通用引物(27F:5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′;下游引物1492R:5′-CTACGGCTACC TTGTTACGA-3′)，Eric分型引物參照文獻[20]設計Eric分型引物(Eric-F:5 ′-ATGTAAGCTCCTG GGATTCAC-3,Eric-R:5′-AAGTAAGTGACTG GGGTGAGCG-3′) 由泓訊生物科技有限公司合成。

立式大容量全溫振蕩培養箱 上海知楚有限公司;超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;PCR儀器 美國Bio-rad公司;Nanodrop 2000微量分光光度計 美國Thermo公司;凝膠電泳成像系統 上海天能科技公司;RiboPrinter全自動微生物指紋鑒定系統 美國Dupont公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 挑取36株產蛋白質谷氨酰胺酶分離株單克隆接種于裝有25 mL種子培養基的三角瓶中,30 ℃、200 r/min,振蕩培養12 h,取1 mL菌懸液于1.5 mL EP管中,4 ℃,10000 r/min,離心5 min,棄上清,收集菌體,進行后續基因組提取。基因組抽提具體步驟參照TAKARA基因組DNA抽提試劑盒說明書完成。然后,用核酸/蛋白濃度檢測儀測定所提取的基因組濃度,并進行1%瓊脂糖凝膠電泳,檢測提取效果。

1.2.2 16S rDNA序列測定及分析 PCR反應體系為25 μL,引物各1 μL,1 μL的DNA稀釋液,預混液12.5 μL,補充9.5 μL ddH2O 至終體積為25 μL。PCR擴增程序:94 ℃預變性5 min,30 個循環(94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s),72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,于紫外凝膠成像儀下觀察PCR擴增結果。

1.2.3 ERIC-PCR擴增 反應體系為2×Taq PCR StarMix 10 μL,模板DNA 1 μL,ERIC上游引物1 μL,ERIC下游引物1 μL,補ddH2O至終體積為20 μL。反應條件為95 ℃預變性7 min,94 ℃變性1 min,52 ℃退火1 min,65 ℃延伸8 min重復30個循環,最后,65 ℃再延伸16 min,以確保反應充分。PCR擴增產物電泳條件:1%瓊脂糖凝膠,電壓100 V,時間1 h。經凝膠呈像后,用Gel-Pro analyzer 4.0凝膠定量分析軟件進行擴增條帶分析,特定位點有條帶記為1,無條帶記為0,采用NTsys 2.10e軟件中的非加權組平均法(UPGMA)進行聚類分析。

1.2.4 全自動核糖體分子分型 將甘油保存已鑒定的33株解朊金黃桿菌菌種在LB平板分離純化(四區劃線),30 ℃恒溫培養箱中倒置培養48 h,長出單克隆。用菌落采集棒蘸取少量單菌落,將細菌加入含有40 μL樣本緩沖液的微量離心管中,用移液器吹打混勻,形成菌懸液。將30 μL菌懸液加入到Riboprinter樣本管中,放入配套熱處理儀進行滅活,處理約30 min。向熱處理后的樣本中加入裂解液A和裂解液B各5 μL,制成上樣液。打開儀器,進行程序自檢,設置操作程序和參數,在指定位置安裝酶管(PvuⅡ)、尼龍膜、1%瓊脂糖凝膠盒、基質盒、純凈水、樣品盛放管,放置完畢后啟動程序。菌株分型結果的圖譜在BioNumerics軟件中采用UPGMA法進行聚類分析。

1.2.5 菌株產酶能力的測定 將33株解朊金黃桿菌挑單克隆接種于種子培養基,30 ℃,200 r/min,振蕩培養12 h。復蘇后的種子液吸取600 μL接種于裝有20 mL發酵培養基的三角瓶中,30 ℃,200 r/min,培養12 h。酶活性測定方法:100 μL含10 mmol/L Cbz-Gln-Gly磷酸鈉緩沖液,與10 μL發酵上清液混合均勻,37 ℃溫育30 min,然后加入100 μL 12%三氯乙酸終止反應;對照組先加入100 μL三氯乙酸,終止時加入100 μL底物溶液。根據盧玉棋[21]等的方法檢測上清液中單位酶活。

圖2 分離產蛋白質谷氨酰胺酶菌株和相關菌株16S rDNA基因序列建立的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree establishment of protein-glutaminase producing isolates and relation strain 16S rDNA gene sequences注:虛線框中菌株均為本實驗室從土壤中篩選的產蛋白質谷氨酰胺酶野生株, 其中X代表33株解朊金黃桿菌,基本信息如圖2左上角表中所示。

2 結果與分析

2.1 產蛋白質谷氨酰胺酶菌株全國不同地區分布狀況分析

從來自全國18個省、市、自治區的土壤樣品中分離獲得206株產蛋白質谷氨酰胺酶的菌株,結合土壤樣品采集地,分析富集篩選效率,結果如圖1所示,不同地區分離篩選到菌株的陽性率差異較大,其中,采集自上海的土壤樣品陽性率最高,可以達到46%,其次為來源于河南的土壤樣品,陽性率為37%,此外,盡管陽性率較低,但在我國的四川、安徽等地同樣篩選獲得產蛋白質谷氨酰胺酶野生株。

圖1 產蛋白質谷氨酰胺酶菌株 在全國不同地區的分布狀況Fig.1 The distribution of protein-glutaminase producing strains in different regions of China注:陽性率是指篩選到產蛋白質谷氨酰胺酶菌株的百分比, 即產蛋白質谷氨酰胺酶菌株數量/總菌株數量;顏色由淺到深陽性率從0～50%。

2.2 16S rDNA序列分析及系統進化樹構建

結合菌株的形態特征、生理生化特以及酶產量,從分離篩選的206株產蛋白質谷氨酰胺酶野生株挑選出36株作為代表菌株,進行16S rDNA序列測定,構建了36株菌和部分相關種模式株16S rDNA 基因序列在內的系統發育樹。如圖2所示,結果表明,其中3株產蛋白質谷氨酰胺酶菌株為產吲哚金黃桿菌,為條件致病菌。另外33株為解朊金黃桿菌,該菌株在2007年,已對產蛋白質谷氨酰胺酶的解朊金黃桿菌進行了致病性和毒性分析[9],結果表明該菌無致病性和毒性,可應用于食品工業,因而后續將重點對該33株解朊金黃桿菌進行分型分析。Q1、Q2、Q4、Q5等33株菌與安全性較高的模式菌株Chryseobacteriumproteolyticum聚為一個類群,QRD12462、QRD121161兩株菌則可聚類為Chryseobacteriumindologenes,菌株CMJ01105可聚類到Chryseobacteriumculicis。

表1 33株解朊金黃桿菌分離株的菌株來源信息Table 1 Information of 33 Chryseobacterium proteolyticum isolates

2.3 ERIC-PCR分子分型

從ERIC-PCR擴增圖譜結果如圖3所示,33株解朊金黃桿菌可擴增出3～9條大小位于100～10000 bp之間的片段,其中1300、600、550 bp這三個條帶為所有菌株共有的條帶,其余為特異性條帶。泳道11、15、23、24、26泳道的菌株的指紋圖譜帶型差異最大,呈現出明顯的DNA多態性。解朊金黃桿菌的ERIC-PCR指紋圖譜的聚類學分析結果如圖4所示,在相似性水平為75%時,將33株解朊金黃桿菌分為2個簇群,在圖右側分別標記為Ⅰ、Ⅱ族群。根據菌株生存地理環境進行分析,結果如表2，菌株Q4,Q5,Q7,Q8,Q9,Q10,Q11,Q12均來自上海,這9株解朊金黃桿菌分離自上海土壤樣品,均聚類于族群Ⅰ。聚類于族群Ⅱ的菌株,除菌株Y8分離自四川的土壤樣品以外,其余全部是分離自河南省的土壤樣品,這表明解朊金黃桿菌的遺傳進化關系上與地理環境存一定的關聯。

圖3 解朊金黃桿菌ERIC-PCR結果圖Fig.3 Chryseobacterium proteolyticum ERIC-PCR results注:從左至右依次為Marker:DL10000 Marker;1～33號泳道為來自不同地區的 解朊金黃桿菌(具體菌株標號信息見表1)。

2.4 全自動核糖體分子分型結果

本文采用PvuⅡ限制性內切酶,通過RiboPrinter系統,將33株解朊金黃桿菌進行核糖體分型,如圖5所示,每個菌株都會產生特征性條帶型。通過與杜邦鑒定數據庫中的解朊金黃桿菌條帶比較,33株分離菌株中相似性均在0.90以上,系統判定33株菌株均為解朊金黃桿菌。雖然33株菌株都是解朊金黃桿菌,但在指紋圖譜上仍可觀察到菌株之間的條帶差異。以相似性水平為92%時,可將33株解朊金黃桿菌分為兩個簇群。結合菌株生存地理環境進行分析,結果如表3:分離自上海的解朊金黃桿菌基本全部位于第Ⅰ族群,第Ⅱ族群中除Y8分離自四川省綿陽市、Q7分離自上海市外,其余解朊金黃桿菌全部分離自河南省。這一結果與ERIC-PCR分型基本一致,均說明了解朊金黃桿菌的遺傳進化與地理環境存在一定關聯。

表2 采用ERIC-PCR分型技術分析解朊金黃桿菌分型分布情況Table 2 Analysis of Chryseobacterium proteolyticum type distribution using ERIC-PCR

表3 采用全自動核糖體分型技術分析解朊金黃桿菌分型分布情況Table 3 Analysis of Chryseobacterium proteolyticum type distribution using automatic ribotyping

圖4 ERIC-PCR聚類分析圖Fig.4 ERIC-PCR clustering analysis

2.5 菌株產酶能力與分型結果相關性分析

通過ERIC-PCR分型方法和全自動核糖體分型方法對33株解朊金黃桿菌進行遺傳多樣性研究,結果表明33株解朊金黃桿菌存在遺傳進化上存在差異。張艷芳等[22]從全國25個省、直轄市采集土樣,分離出456株產蛋白質谷氨酰胺酶菌株,其中酶活高于0.5 U/mL的菌株僅占2.85%。本研究通過對33株解朊金黃桿菌的產酶能力進行分析,探究解朊金黃桿菌產酶能力與采樣環境之間的聯系,結果如圖5所示,在第Ⅰ簇群中菌株單位酶活大部分低于0.5 U/mL,而第Ⅱ簇群的菌株單位酶活大部分在0.5 U/mL以上,占該族群菌株數的95.23%,占解朊金黃桿菌總菌株數的60.60%,篩選到高產菌株的概率大大提高。同時,該族群Ⅱ中90.48%菌株采樣來自河南省地區,因而推測高產菌株的分布可能與地理環境存在一定關系。

3 結論與討論

圖5 全自動核糖體分型聚類分析圖Fig.5 Automatic ribotyping clustering analysis注:以酶活為0.5 U/mL作為PG酶活高低差異性的分界線。

本文從來自全國不同地區的土壤樣品中篩選到206株產蛋白質谷氨酰胺酶的菌株,并通過16S rDNA鑒定,其中33株為食品安全菌株解朊金黃桿菌。通過結合傳統的ERIC-PCR分型方法和全自動核糖體分型方法對33株來自土壤的解朊金黃桿菌野生菌株進行分子分型,ERIC-PCR指紋圖譜的聚類學分析結果顯示,33株解朊金黃桿菌分為2個簇群,且聚類于族群Ⅰ的菌株全部來源于上海的土壤樣品,而族群Ⅱ基本來源于河南的土壤樣品。而核糖體分型結果也與ERIC-PCR分型結果一致。一定程度上表明解朊金黃桿菌的遺傳多樣性豐富,可能與菌株來源的地理環境多樣性存在聯系。為了高效準確篩選獲得高產目的菌株,本研究分析菌株產酶能力與分子分型之間的關聯,結果表明,ERIC-PCR分型方法和全自動核糖體分型聚類于第Ⅱ簇群的菌株產酶能力普遍高于族群Ⅰ,結合不同族群菌株來源地理環境,推測菌株產酶能力可能與所處地理環境存在緊密關聯。

為了找到滿足工業化生產的菌株,常常需要從自然環境中分離出大量菌株進行篩選。對于這些菌株的特性與功能需要逐個研究,同時在同一份土壤中分離出的菌株遺傳相似性很高,其中大多數來自同一個克隆,因此對于同一個分離樣品中微生物的多樣性分析對功能性菌株的快速篩選就變得非常重要。傳統微生物的分型一般是以菌株的表性特征進行劃分,如血清型、毒性、生化鑒定等,但這些鑒定標準易受環境因素干擾,影響了菌株分型的準確性[23]。隨著分子分型技術的發展,分子生物學分型方法被科研人員廣泛使用,使傳統方法的不足得到彌補。與此同時,分子分型技術操作簡單快捷,區分指數較高[24]。

腸道細菌基因間重復序列擴增(ERIC-PCR)是日常實驗室進行細菌分型分種的一種常見方法。1990年,Sharples等[25]首次在大腸桿菌基因組中發現在其ds的3′末端區存在ERIC片段,后將該片段命名為“基因間重復單位”序列。Versaloviv等[26]根據ERIC的核心序列設計了一對反向引物,在進行ERIC-PCR擴增時,兩個相鄰ERIC保守序列之間的區域就擴增出來,因為不同的細菌基因組上的ERIC重復序列的數目和分布不同,最終就形成很多大小不同的DNA擴增片段,構成菌株的指紋圖譜。自動化核糖體基因分型系統(Riboprinter)是基于分子生物學的知識,對微生物進行進化分型的常用工具[27-28]。由于金黃桿菌菌株間差異較小,所以準確且靈敏的菌株區分方法對于解朊金黃桿菌的分類鑒定非常重要。雖然結果表明兩種分型方法聚類結果大體一致,但核糖體分型方法的分辨能力更高。由于部分解朊金黃桿菌在親緣關系上存在高度同源,ERIC-PCR分型無法精確地對菌株之間的細微差異做出分辨,然而,全自動核糖體分型技術借助先進的儀器設備,可對菌株之間的微弱差異做出分辨。綜合考慮分型技術的分辨率,精確率,實驗耗材費用等,在早期實驗,可以采用ERIC-PCR進行細菌分型實驗。由于全自動核糖體分型技術的儀器設備較為昂貴,不便于在實驗室大規模推廣使用,可以采用ERIC-PCR分型確定菌株存在差異后,再用全自動核糖體分型技術對菌株進行精確的比較分型。

通過ERIC-PCR分型和全自動核糖體聚類分型,可進一步對同一種屬的菌株種進行遺傳差異性分析,同時,其遺傳分群與菌株采樣地理環境存在一定的聯系。從核糖體分型結果可以看出,來自河南地區的土壤樣品中分離的解朊金黃桿菌與其他地區分離株相比其產酶能力比較高,推測菌株的產酶能力與菌株采集地存在一定關聯。結合菌株遺傳分群與地理來源的關系,對采集自河南的樣本分析,本研究中河南的土樣主要來自于周口、開封等豫東地區的多個區縣,研究報道[29]豫東平原屬于鹽堿土質,因而,推測可能是因為解朊金黃桿菌產生的蛋白質谷氨酰胺酶可以作用于蛋白質,釋放出游離氨分子,使環境堿度增加,在堿性較高的土壤中解朊金黃桿菌表現對強堿的耐受性,故菌株產酶能力較高。但由于本研究中菌株數量和來源有限,對于菌株采集環境與產酶能力之間的聯系有待進一步驗證。但是,目前該結果已初步表明高產菌株的遺傳族群與地理來源存在一定的關聯,這為以后根據采樣環境來高效篩選高產蛋白質谷氨酰胺酶野生株提供了新思路。