MicroRNA21 在傷口愈合中的作用及研究進展

郝兆虎，黃霄，邵海琳（通信作者）

1 天津市第四中心醫院代謝性疾病管理中心 （天津 300140）；2 國家衛生健康委員會激素與發育重點實驗室（天津醫科大學），天津市代謝性疾病重點實驗室，天津醫科大學朱憲彝紀念醫院 & 天津市內分泌研究所 （天津 300134）

傷口愈合過程是一種正常的生理反應，其過程復雜，大致可以概括為3個階段，即炎癥階段、增殖修復及組織重塑階段。創面愈合困難包括慢性創傷及病理性瘢痕修復，是一個世界性的問題，對社會及個人造成了沉重的經濟[1]和醫療負擔[2]。隨著社會老齡化、肥胖及糖尿病發病率的增加，傷口愈合困難將表現得更為顯著[3]。MicroRNAs（miRNAs）是一種短內源性非編碼RNA，平均長度約為22個核苷酸，介導基因表達的轉錄后調控；miRNAs 幾乎參與動物所有的發育和病理生理過程[4]。MicroRNA21（miR21）是近年來研究比較深入的miRNAs 之一，定位于17q23.2染色體，廣泛表達于哺乳動物各器官組織中，它可通過抑制人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）、 程序性死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）、肌球蛋白1（tropomyosin 1，TPM1）等抑癌基因來促進腫瘤的發生發展。目前，miR21在腫瘤、心血管疾病、糖尿病及其并發癥、皮膚病、自身免疫疾病方面的作用已得到了廣泛的重視[5]。目前的研究表明，miR21在傷口組織中被上調，miR21敲除后，傷口愈合困難，膠原沉積受到抑制，miR21過表達則加速傷口愈合[6]。本研究對miR21在傷口愈合過程中的相關作用進行綜述。

1 傷口愈合過程中miR21 與多種miRNAs 相互協作促進愈合

miRNAs在傷口愈合過程中各個階段起著重要作用，miR21與多種miRNAs相互協作，促進傷口的愈合。在炎癥階段，miR146a[7]、miR155[8]、miR132[9]、miR21[10]、miR125b[11]、miR223[12]在創面愈合過程中有促進或抑制炎癥反應的作用；在增殖過程中，miR21[13]、miR132[14]、miR31[15]、miR99[16]、miR210[17]對角質形成細胞、成纖維細胞及肉芽組織形成有重要影響；在創面修復的重塑階段，miR29[18]、miR192[19]等通過對膠原及細胞外基質的表達的影響，對防治瘢痕修復有重要作用。在創面愈合過程中，miR21在炎癥及增殖階段都起著關鍵作用，當miR21被抑制時，再上皮化過程會被延遲，受損的傷口收縮也會被抑制[20]。

2 miR21 在炎癥階段的作用

有研究表明，miR21在皮膚形態結構發育過程中可能有重要作用。杜克大學醫學中心學者研究表皮和毛囊之間存在差異表達的miRNAs 家族，從相應的表皮和毛囊庫中檢索到1245和1 113個miRNAs，發現miR21在表皮及毛囊中是高表達的[21]，可能對皮膚的功能及結構有重要作用。皮膚是人體最大的器官，約占成年人體重的16%。由于皮膚直接暴露在空氣中，對人體起到保護作用，所以皮膚也是最易受傷害的器官。創面的修復與皮膚功能密切相關。皮膚疾病研究表明，miR21在銀屑病患者表皮中是明顯偏高的，可能與銀屑病的發生有關[22]。傷口愈合的早期階段包括止血、角質形成細胞和炎癥細胞的活化，中性粒細胞對入侵微生物及壞死物質進行處理，巨噬細胞可通過清除創面局部的中性粒細胞及凋亡細胞調節炎癥反應，避免形成持續慢性炎癥反應及慢性創面[23]。凋亡細胞的清除障礙是慢性炎癥及自身免疫疾病的重要原因[24]。與病原體攝取或Fc 受體（Fc receptors，FcR）介導的吞噬作用不同，這種情況下吞噬凋亡細胞并不會導致巨噬細胞產生促炎性細胞因子[25]，是一種非炎癥性和非免疫原性的過程。最近的研究表明，通過miR21調節存在負調控機制來限制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的毒性作用并能夠及時對凋亡細胞進行清除[26]。炎癥的刺激可誘導miR21的表達[27]，對炎癥進行調控[10]。miR21可以通過沉默促炎癥因子白細胞介素-12的表達來減輕炎癥反應[28]。俄亥俄州立大學韋克斯納醫學中心研究miR21在創傷發生后炎癥消退過程中的作用及其機制時，從新鮮的血液中通過密度梯度離心法分離人外周血單核細胞，再誘導分化為巨噬細胞，加入LPS 處理6 h 或24 h 后，吞噬凋亡細胞的巨噬細胞中miR21的表達明顯升高[10]。PTEN是一種雙蛋白-脂質磷酸酶，能夠磷酸化PI3K 產生的第二信使，并阻斷Akt 的下游活化[29]。miR21通過沉默PTEN 和GSK-3β，減少TNF-α 產生，抑制LPS 誘導的炎癥反應[10]。白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）是繼炎癥后釋放的最強的抗炎細胞因子之一[30]。有研究表明，IL-10在巨噬細胞吞噬凋亡細胞之后的釋放增多[31]。PDCD4通過抑制絲裂原活化蛋白激酶1的表達來阻斷c-jun 的活化，后者的活化參與單核細胞IL-10的轉錄激活[32]，巨噬細胞中miR21通過沉默PDCD4，從而有利于c-jun 的活性，從而產生更高水平的抗炎物質細胞因子IL-10[10]。

3 miR21 在傷口愈合增殖階段的作用

皮膚創面愈合是一個高度精心安排的多步驟過程。在創面炎癥階段后期，巨噬細胞浸潤并產生各種生物活性物質，如表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、轉化生長因子-α（transforming growth facto-α，TGF-α）和血小板衍生生長因子（plateletderived growth factor，PDGF）促進成纖維細胞增殖、遷移和血管生成，從而促進肉芽組織的形成[6]。動物研究表明，在創傷形成第7天的時間點進行微陣列法檢測miRNAs譜，發現743個miRNAs中33個miRNAs上調，21個miRNAs下調超過正常皮膚的2倍以上，miR21上調3.1倍[33]，miR21拮抗藥處理過的傷口的邊緣皮膚變得松散張力，創面愈合延遲；提示miR21可能參與了傷口的早期收縮，病理顯示miR21拮抗劑給藥導致表皮和真皮的張力下降，這可能是miR21拮抗劑造成愈合延遲的原因之一[34]。在增殖階段，傷口愈合的一個基本特征是再上皮化，主要依賴于角質形成細胞的增殖和遷移這2個基本功能[35]。此過程中，TGF-β1的表達顯著增加，角質形成細胞是TGF-β1的主要靶細胞。已有研究表明，TGF-β1通過轉錄后機制促進人血管平滑肌細胞和結腸癌細胞成熟miR21的表達[36]。有研究應用人角質形成細胞株（human keratinocyte cultures,HaCaT），發現TGF-β1處理后6 h，miR21表達顯著增加，處理12 h后角質細胞遷移顯著提高48%；表明TGFβ1可以通過上調HaCaT細胞的miR21表達來促進角化細胞遷移，內源性miR21敲除導致再上皮化受損[20]，miR21下調所致的延遲再上皮化可能是由于角質形成細胞遷移減少所致，miR21可能通過介導PTEN抑制組織金屬蛋白酶抑制劑-3（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 3，TIMP 3）和T淋巴瘤浸潤誘導蛋白（T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1，TIAM1）的表達，促進角質形成細胞遷移和創面愈合。糖尿病患者傷口愈合嚴重受損，超過8周被認為是慢性的傷口；在細胞水平上，這與糖尿病使炎癥反應延長、新生血管受損和膠原合成減少有關；在動物研究中發現，糖尿病傷口及非糖尿病傷口中10多種miRNAs在糖尿病傷口的皮膚中的表達存在明顯差異[37]。miR21促進皮膚成纖維細胞向創面遷移，促進傷口的愈合[20]。據報道，miR21對外周樹突狀細胞的分化和功能也有調節作用[38]。樹突狀細胞是一種特殊的抗原遞呈細胞，在免疫應答中起著重要的作用，研究表明其通過分泌I型干擾素促進創面愈合，miR21通過抑制PTEN激活AKT/PI3K信號通路增加樹突狀細胞促進創面愈合[6]。

4 miR21 在傷口愈合組織重塑階段的作用

皮膚創傷后，傷口愈合過程復雜，包括延長再上皮化、機械應力增加、止血、炎癥[39]、細胞外基質產生以及重塑。TGF-β1信號通路可促進傷口愈合、瘢痕形成及纖維化[39]。膠原纖維沉積和重塑是創傷后期重要的修復過程。某些患者在嚴重創傷、手術及燙傷后皮膚常并發不同程度的增生性瘢痕，突出皮面，形態不規則，高低不平，這不僅會影響患者容貌，甚至會出現嚴重的畸形和功能障礙，可能導致患者出現心理障礙，降低患者生命質量。對于大多數深及真皮的增生性瘢痕，由于創面深，可形成永久性的瘢痕。瘢痕組織內成纖維細胞過度增殖，鏡下可見形態粗大且呈極性排列的膠原大量沉積。 TGF-β 是增生性瘢痕形成中細胞與細胞外基質間重要的信號轉導因子，這些細胞因子的異常表達可導致皮膚創面愈合異常。Smads 蛋白（drosophila mothers against decapentaplegic protein，Smads protein）可把TGF-β 信號從細胞外傳遞到細胞內，影響增生性瘢痕的形成及細胞外基質沉著。TGF-β/Smads 信號轉導途徑及結締組織生長因子轉導途徑被證實與瘢痕形成存在密切關系[40]，在體外培養的人增生性瘢痕成纖維細胞發現PDCD4表達偏低，而miR21表達則顯著升高；提示其可能參與增生性瘢痕的形成及演變過程，并推測由于miR21基因的激活，抑制PDCD4蛋白表達同時促進TGF-β1/Smad7信號通路，最終減弱PDCD4蛋白對增生性瘢痕成纖維細胞的抑制作用，1和3型膠原表達上調，從而造成傷口表面的過度增生。對于增生性瘢痕患者，目前傳統的手術治療不僅會對人體產生二次損傷，甚至還會出現瘢痕的再次增生。有學者通過在兔耳瘢痕形成瘢痕增生后，利用miR21拮抗藥物后發現對瘢痕治療效果顯著。有研究通過收集了患者的增生性瘢痕組織和正常皮膚組織，經常規病理檢查證實并經細胞培養發現，人增生性瘢痕成纖維細胞和正常纖維母細胞分別從3種增生性瘢痕組織和正常皮膚組織中分離得到，TGF-β1通過miR21調節纖維化的表達，而miR21則通過Smad 7調控纖維化的表達，這表明miR21在調控中起著至關重要的作用，TGF-β1/miR21/Smad 7信號通路是治療增生性瘢痕患者的有效靶點[41]。

目前，干細胞治療已經成為改善皮膚傷口愈合的有力工具。人臍帶血（umbilical cord blood，UCB）是一種有吸引力的可移植干細胞的來源，可用于傷口修復，在其機制研究中應用臍帶血干預創面后采用定量實時PCR 技術檢測了miRNAs 含量，發現其中miR21-3P 的表達水平最高，其靶基因在24 h 后明顯降低，得出臍帶血治療中通過miR21-3p 抑制PTEN 和側支發芽因子同源物1）Sprouty Homolog 1，SPRY1）對內皮細胞的產生促血管生成作用，從而可加速皮膚創傷的修復和恢復[42]。miR21對皮膚的影響不僅在創面愈合方面，在砷等引起的疾病患者中，miR21表達顯著上調，在皮膚病變中，相對于其對照組達到了4.5倍，下游的PTEN、PDCD4則明顯下降，提示miR21在此類皮膚疾病中也可能有重要意義[43]。銀屑病研究中發現，不管是在表皮還是在真皮T 細胞里，miR21的水平都較健康對照組升高，轉染 miR21抑制體后T 細胞的凋亡率增加，銀屑病癥狀可緩解，因此miR21可能成為銀屑病患者治療的一個新靶點[44]。

5 展望

傷口愈合是一個復雜的過程，涉及一系列組織修復細胞，包括成纖維細胞、上皮細胞、內皮細胞和白細胞之間的協調相互作用。miR21從表皮細胞增殖、遷移和分層、膠原合成、沉積和組織等多方面對創面愈合產生影響。miR21轉染基因治療后可加快皮膚創面愈合，這種促愈效應與其促進成纖維細胞和表皮細胞的遷移、減輕炎性細胞浸潤、促進肌成纖維細胞的轉分化等密切相關，miR21可能成為促進創傷愈合的靶點。