中鏈脂肪酸及其α-單脂肪酸甘油酯的抗菌研究

---單一作用和協(xié)同作用

人們普遍認為，人初乳和牛乳的抗菌活性是由甘油三酯通過脂肪酶水解，釋放脂肪酸（FAs）和α-單脂肪酸甘油酯（MGs），它們共同構(gòu)成母乳喂養(yǎng)嬰兒抵御入侵病原體的第一道防線（Isaacs,2005）。在這些牛乳成分中，中鏈FAs（C-8到C-14）及其MGs對通過口腔和鼻傳播的病毒和B組鏈球菌最為有效。因此，這些化合物被用作配方乳的添加劑，以防止或減少嬰兒口腔和上呼吸道黏膜的感染（Isaacs等，1995）。此外，研究表明，一些中鏈FAs和MGs抑制了細菌的抗生素抗性基因，并引起了頻率相對較低的自然耐藥 （Petshow等，1996；Ruzin和 Novick，1998）。這一事實以及發(fā)現(xiàn)這些化合物在小濃度下是無毒的，使得它們有望作為抗生素或替代抗生素來治療不同的疾病 （Bergsson 等，2001；Nair等，2005；Rouse 等，2005）。

在所有中鏈脂肪酸中，月桂酸（C-12）具有最大的抗菌活性。當酸酯化為甘油酯時，這種作用會被放大，從而產(chǎn)生α-單月桂酸甘油酯，中鏈MGs中抗菌效果最佳。α-單月桂酸甘油酯對革蘭氏陽性致病菌和腐敗菌具有活性。然而，當與其他物質(zhì)結(jié)合時，其活性可以被加大。例如，當與EDTA或檸檬酸鹽等陽離子螯合劑結(jié)合時，α-單月桂酸甘油酯對革蘭氏陰性菌具有活性。此外，還可以觀察到α-單月桂酸酯與多種其他食品成分（如磷酸酯、抗氧劑和酸化劑）有協(xié)同抗菌的作用（馬歇爾，1998）。由于其長期安全使用的記錄，α-單月桂酸甘油酯單獨或與抗生素相結(jié)合，可被證明在預(yù)防和治療嚴重的細菌感染，特別是那些難以治療或耐抗生素的細菌感染方面是有用的（Preuss等，2005 年）。

本研究初步檢測了所有中鏈 FAs，即辛酸（C-8）、癸酸（C-10）、月桂酸（C-12）和肉豆蔻酸（C-14）及其對應(yīng)的MGs（α-單辛酸甘油酯、α-單葵酸甘油酯、α-單月桂酸甘油酯和α-單豆蔻酸甘油酯）對葡萄球菌、棒狀桿菌、芽孢桿菌、李斯特菌和鏈球菌等革蘭氏陽性菌有抗菌活性。進一步研究了活性最強的化合物α-單月桂酸甘油酯與抗菌活性較好的化合物之間簡單的協(xié)同關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料 中鏈脂肪酸辛酸、癸酸、月桂酸和肉豆蔻酸及其合成α-單脂肪酸甘油酯所需的所有化學(xué)物質(zhì)均以高純度從Aldrich購買。試驗培養(yǎng)物：金黃色葡萄球菌Rosenbach 209、金黃色葡萄球菌ATCC 33862 USA、金黃色葡萄球菌146 MR、表皮葡萄球菌1093、白喉桿菌 39179、蠟樣芽胞桿菌157、李斯特菌C12和化膿鏈球菌15346取自Stefan Angeloff微生物研究所，保加利亞科學(xué)院和國家藥物管制研究所。

1.2 MGs的合成 MGs的合成分為兩個步驟，見圖1（Batovska等，2004）。 簡單地說，首先通過外消旋2，2-二甲基-1，3-二氧環(huán)戊烷-4-甲醇與酸性氯化物反應(yīng)，得到它們的丙酮化合物。用強酸性離子交換樹脂對生成的丙酮化合物進行保護。

1.3 瓊脂擴散法 用瓊脂擴散法檢測肉質(zhì)蛋白胨瓊脂上生長的細菌的抗菌活性 （Spooner和Sykes，1979）。 將 200 μL 細菌懸液（105個細胞/mL）置于培養(yǎng)皿的瓊脂層上（直徑10 cm）。每個盤子準備5個孔，每個孔直徑10 mm。將每個100 μL的樣品，溶解在96%乙醇溶液（5 000 μg/mL）中再添加到適當?shù)目字小τ陬A(yù)擴散，將培養(yǎng)皿放置在4℃下2 h；在37℃下培養(yǎng)48 h后，根據(jù)瓊脂層中抑制區(qū)的直徑估計抗菌活性，試驗重復(fù)進行3次，具有至少16 mm直徑的抑制區(qū)的化合物具有活性。對照組試驗用純?nèi)軇┻M行。

1.4 連續(xù)稀釋法 采用在線實驗室手冊（2000）中所述，用肉湯管稀釋法測量單個化合物及其混合物的最小抑制濃度 （MIC）。用Mueller-Hinton肉湯將每個樣品在試管中連續(xù)稀釋至0.0~2 000 μg/mL，測定MIC。每根試管接種含有105個細胞/mL的細菌懸浮液，并在35℃下培養(yǎng)過夜。與接種有微生物懸浮液的無藥肉湯相比，明顯沒有生長的最高稀釋度被認為是MIC。為了更精確的檢測，在新鮮肉類蛋白胨瓊脂平板上劃出沒有可見生長的試管，在35℃下培養(yǎng)24 h，并檢查生長情況。

2 結(jié)果和討論

本研究評價了中鏈脂肪辛酸（C-8）、癸酸（C-10）、月桂酸（C-12）和肉豆蔻酸（C-14）及其對應(yīng)的MGs（α-單辛酸甘油酯、α-單葵酸甘油酯、α-單月桂酸甘油酯和α-單肉豆蔻酸甘油酯）對革蘭氏陽性菌的抗菌活性，表1和表2分別列出了FAs和MGs的抑制區(qū)（dinh）和最小抑制濃度（MIC）的直徑。

表1 中鏈FAs的抗菌研究結(jié)果

表2 中鏈GMs的抗菌研究結(jié)果

脂肪鏈具有12個碳的α-單月桂酸甘油酯是所有被測化合物中最活躍的（見表2），它能強烈抑制葡萄球菌和鏈球菌的生長，這是唯一對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌有效的化合物；其他的MGs，如α-單葵酸甘油酯和α-單肉豆蔻酸甘油酯，它們與α-單月桂酸甘油酯相差2個碳原子，其活性明顯降低；而8個碳原子脂肪鏈的α-單辛酸甘油酯沒有表現(xiàn)出任何活性。

眾所周知，月桂酸具有抗菌活性，當脂肪酸與甘油酯化生成α-單月桂酸甘油酯時，其抗菌活性增強。有一種說法認為，α-單月桂酸甘油酯的甘油部分是親水載體，可以通過細菌細胞膜傳遞月桂酸，在細菌細胞膜上表現(xiàn)出抗菌活性 （Ruzin和Novick，2000）。如果是這樣的話，可以推測α-單月桂酸甘油酯將顯示出比月桂酸更強的抗菌活性。此外，通過保護其羥基消除甘油部分的親水性將導(dǎo)致更多的非活性化合物。在這一關(guān)系中，研究比較了月桂酸、α-單月桂酸甘油酯和具有兩個封閉羥基的α-單月桂酸甘油酯的丙酮化合物的抗菌效果（見表3）。未結(jié)合的月桂酸抑制化膿性鏈球菌，MIC為125 μg/mL；當酸與甘油結(jié)合時，這種活性增加了4倍。出乎意料的是，阻斷α-單月桂甘油酯中甘油部分的兩個羥基有利于其抗菌活性，而α-單月桂酸甘油酯的丙酮化合物的抗菌活性是游離月桂酸的32倍，是α-單月桂酸甘油酯的8倍。該化合物對化膿性鏈球菌細胞有一定的特異性作用。此外，α-單脂肪酸甘油酯的丙酮化合物對其他細菌，如李斯特菌和白喉桿菌完全不起作用 （見表3）。這可能是因為甘油部分受保護的羥基通過這些細菌細胞膜的滲透干擾了整個分子。

表3 月桂酸、α-單月桂酸甘油酯和單月桂酸甘油酯的丙酮化合物對所選細菌的MIC值（μg/mL）

考慮到α-單月桂酸甘油酯的抗菌活性會受到其他活性化合物的影響，我們檢測了該MGs的一些兩種混合物和最接近的抗菌活性的化合物。因此，選擇α-單葵酸甘油酯和α-單肉豆蔻酸甘油酯作為繼α-單月桂酸甘油酯對抗金黃色葡萄球菌209后的第二大活性成分，并以不同比例分別與α-單月桂酸甘油酯混合這些混合物，對金黃色葡萄球菌209的抗菌研究結(jié)果表明，只有當α-肉豆蔻酸甘油酯的含量與α-單月桂酸甘油酯相同（比例1:1）或較少（比例1:2）時，才具有協(xié)同作用（見圖2）；α-單葵酸甘油酯不與α-單月桂酸甘油酯發(fā)生協(xié)同作用（見圖2）。當使用單核細胞增生李斯特菌和白喉桿菌作為試驗菌時，月桂酸也發(fā)現(xiàn)了同樣的情況（見圖3-圖4）。當對化膿性鏈球菌進行研究時，發(fā)現(xiàn)α-單月桂酸甘油酯與α-單葵酸甘油酯以及α-單月桂酸甘油酯與活性差的月桂酸之間存在協(xié)同關(guān)系（見圖5）。在這些情況下，其中一種成分優(yōu)于另一種成分2倍的混合物比單獨的某種成分更為活躍。此外，組成成分比例為1:1也是不利的。活性的α-單月桂酸甘油酯與月桂酸之間的協(xié)同關(guān)系表明，α-單脂肪酸甘油酯與抗菌活性較弱的化合物的組合也值得關(guān)注。在這方面，不僅應(yīng)檢查兩種成分的混合物，而且還應(yīng)檢查含有3種以上組分的復(fù)雜混合物。

總之，中鏈MGs比中鏈FAs更具活性，其中α-單月桂酸甘油酯對各種革蘭氏陽性菌的抗菌活性最強，以化膿鏈球菌為試驗微生物，觀察到以下作用：（1）阻斷α-單月酸甘油酯的甘油部分的羥基，得到具有顯著抗菌活性的化合物；（2）對其兩種組分混合物進行檢測，發(fā)現(xiàn)α-單月桂酸甘油酯與α-單葵酸甘油酯、α-單月桂酸甘油酯與活性差的月桂酸之間存在協(xié)同關(guān)系。

混合后α-肉豆蔻酸甘油酯的含量與α-單月桂酸甘油酯相同或較少時，α-肉豆蔻酸甘油酯與α-單月桂酸甘油酯對金黃色葡萄球菌209也存在協(xié)同作用。

根據(jù)所觀察到的效果，可以開發(fā)出有效的抗菌化合物和脂質(zhì)混合物。致 謝該項工作得到保加利亞國家科學(xué)研究基金會（合同X-1514）的支持。

（本文由福州華康牧業(yè)有限公司技術(shù)部翻譯整理自Batovska D I,Todorova I T,Tsvetkova I,et al.Antibacterial study of the medium chain fatty acids and their 1-monoglycerides:individual effects and synergistic relationships[J].Polish Journal of Microbiolog,2009,58(1):43-47.）