血凝和血凝抑制試驗注意事項

郭 燕

江蘇省泰興市濱江鎮獸醫站，江蘇泰興225400

隨著規模養雞業的迅速發展和養殖戶科學養殖意識的增強，實驗室檢測技術越來越重要。血凝和血凝抑制試驗是實驗室常用的免疫抗體檢測技術之一，主要用于雞新城疫和禽流感病毒病的檢測診斷以及監測雞的免疫狀態。筆者結合日常實驗室操作，淺談該試驗應注意的事項，以供參考。

1 1%雞紅細胞懸液配制

采血應選用3 只SPF 公雞或無新城疫、禽流感病毒抗體的健康公雞，其目的是為了避免某些雞只的紅細胞可能出現自凝現象。采血后將血液迅速加入含抗凝劑的容量瓶中混合均勻，抗凝劑與血液的比例為1:4。離心操作中，注意在離心管加入PBS 液混合時不要用力，防止紅細胞破裂產生溶血。以2 000 r/min 的速度離心5～10 min，離心次數不宜過多，3 次即可。每次離心后，用吸管吸去上層清液和白細胞膜。白細胞膜吸除得越干凈越好。配置好的雞紅細胞懸液放置后若出現上清液呈紅色，說明有溶血，不可使用。

2 試驗器材的準備及操作

血凝和血凝抑制試驗主要用到的器材有96 孔V 形微量反應板、單道或多道微量移液器、吸頭、恒溫培養箱、微量振蕩器等。試驗過程全部無菌操作，試驗人員注意安全，做好自身防護。選用清潔干燥的反應板，移液器吸頭盡量選用合格的一次性產品，一個吸頭只能移取一種溶液。移液器在使用前先進行檢查校正，每個吸頭要牢固固定，以防操作過程中漏氣或掉落。使用時操作要規范，先按下移液器，再將吸頭放入反應孔中吸取樣品。移液器吸頭要垂直懸空加入液體，避免接觸反應板和孔壁。操作要穩，手每次按壓的力度要均衡，確保移液量的準確。樣品稀釋過程中，使用移液器在反應孔中吹打幾次，混合均勻后再吸取移至下一孔。吹打時移液器吸頭不要離開樣品液面，防止產生氣泡影響移液量。

3 血凝價的判定

在紅細胞各組對照孔均正確的情況下，將反應板傾斜，觀察紅細胞是否完全凝集，能使雞紅細胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數即為該病毒的凝集價。

4 4 單位抗原的配制

根據獲得的血凝價進行4 單位抗原的配制，4單位抗原的稀釋倍數為血凝價除以4，假設測得的血凝價為8log2，4 個血凝單位則為6log2，將抗原做64 倍稀釋即可。也就是取1 mL 病毒抗原加入63 mL PBS 液中即為4 單位抗原。4 單位抗原最好現用現配。

5 抗原回歸試驗

4 單位抗原是血凝抑制試驗中尤為重要的一個環節，其準確性決定了血凝抑制試驗的結果。為防止4 單位抗原配制不準確，在血凝抑制試驗前必須做抗原回歸試驗。抗原回歸試驗觀察結果時，以前2孔完全凝集、后2 孔不凝集為準。若4 孔全部凝集，說明配制濃度過高；4 孔不凝集，說明配制濃度過低。只有在抗原回歸試驗成功的情況下，才能進行下一步的血凝抑制試驗。

6 血凝抑制效價的判定

觀察血凝抑制試驗結果時，將反應板傾斜45°，從反應板背側觀察紅細胞有無呈淚滴樣流掛，以能完全抑制紅細胞凝集的最高血清稀釋倍數判為該血清的血凝抑制效價。

7 試驗后的整理和消毒

試驗結束后，將此次試驗記錄及操作過程中出現的問題進行歸納整理，做好儀器、設備的清潔消毒工作。先將96 孔V 形微量反應板用流水沖洗一遍，然后放入清潔液中浸泡數小時，再取出用流水沖洗干凈，接著用生理鹽水或蒸餾水再沖洗一遍，甩干，放入恒溫箱中烘干，供下次使用。雖然移液器吸頭可以循環利用，但清洗容易有殘留，一般做集中回收進行無害化處理。使用過的器械、設備進行原處歸位，做好日常管護，為下次試驗成功做好預準備。