DNA納米結構在藥物遞送中的應用

馬玉旋，馬 祎，江 雯，高孟秋，顧月清

(中國藥科大學 工學院，江蘇 南京 211198)

自 1982 年美國科學家 Seeman 首次提出 DNA 納米技術的概念以來[1]，DNA納米技術已取得了突飛猛進的進展。其經歷了從一維平面結構、到二維立體結構再到三維空間結構的發展，且發展出了DNA折紙術[2]。到目前為止，以DNA為模板通過堿基特異性互補配對形成納米結構的研究已有數千篇報道。并且隨著研究的深入，針對DNA納米技術的研究目標已經從結構控制逐漸向功能及應用方面發展[3]。特別是近幾年來，DNA 納米結構的自組裝技術日益成熟，其高度的結構可控性、生物安全性及功能多樣性使得 DNA 納米結構成為一種理想的藥物遞送載體[4]。本文總結了DNA納米結構在藥物遞送方面的優勢及應用。

1 DNA納米結構的優勢

核酸因帶負電荷而難以透過表面帶相同負電荷的細胞膜。因此，通常需要轉染試劑(如脂質體、Lip2000等)使細胞有效攝取核酸。但研究發現，與非結構核酸不同，DNA納米結構很容易通過膜屏障，因此 DNA納米結構在藥物遞送方面，具有以下優點。

首先，DNA納米結構可預測且尺寸和形狀可控。通過可編程DNA雜交，可以方便地將DNA納米結構制備成預先設計的尺寸和形狀，產率較高。不同的DNA納米結構的流體力學尺寸通常在10～200 nm左右，這使得它們能夠利用腫瘤區域的EPR效應。此外，具有合適的尺寸和親水性表面的DNA納米結構，可部分減少巨噬細胞在循環過程中的光化反應和隨后的清除[5]。

其次，DNA納米結構具有可編程性和可尋址性。除了結構可編程性外，DNA納米結構還可以方便地修飾多個功能單元[6-11]。這些功能單元(包括靶向適體、抗癌藥物分子、基因序列、蛋白質有效載荷、成像對比探針等) 可通過共價鍵、核酸堿基對、生物素-親和素相互作用、插入、適配體-靶點相互作用、DNA-蛋白質相互作用和包封的方式與DNA納米結構相結合，并顯示出高的負載能力和精準的位置，這使得DNA納米結構在藥物裝載和靶向上成為一種較有吸引力的材料。

此外，DNA納米結構具有被細胞內化的能力。盡管已知核算難以穿透細胞膜，但具有特點幾何結構的DNA納米結構卻可以。Mao等[12]研究發現，葉酸標記的DNA納米管能靶向癌細胞表面的葉酸受體，隨之內化進入腫瘤細胞中。2011年，Turberfield等[13]研究發現，在沒有配體或轉染劑的存在下，DNA四面體能順利進入共培養的活細胞中，說明具有特定結構的DNA納米結構能被哺乳動物細胞內化，而不受DNA表面的電荷影響。

還有，DNA納米結構能穩定存在于正常生理條件下。Yan Meldrum等[14]研究發現DNA折紙結構在細胞裂解液長達12小時孵育下，仍能保持結構穩定，依舊以折紙結構存在。相反，常規的單鏈或雙鏈同條件下孵育后完全檢測不到完整的DNA鏈。Conway等[15]研究發現，具有特點結構的三角形棱狀DNA納米結構在血清中比單鏈更穩定，經凝膠分析得出，在10%胎牛血清中，單鏈和完整結構的DNA 半衰期分別是1小時和2小時，而經化學修飾后的DNA納米結構半衰期大于24小時。

最后，DNA 納米結構具有良好的生物相容性。DNA分子作為一種存在于所有生物中的天然物質，具有固有的生物相容性。一些報道的DNA納米結構已被證明在細胞和動物水平上是安全和免疫惰性的[16]。并且，DNA納米結構最終將在細胞和生物體內被降解和清除[17]。

2 小分子藥物的遞送研究

具有蒽環類結構的化療藥物如阿霉素等可以插入DNA結構，并通過緩解扭轉應力與DNA緊密結合在一起。利用此特征，現已構建了多種較好的載藥DNA納米結構，并對其體外和體內治療效果進行了研究。如Huang等[17]利用DNA二十面體納米結構負載阿霉素，并修飾MCF-7細胞的靶向的適配體進行癌癥治療。研究發現與人乳腺癌細胞株(MCF-7)孵育后，靶向DNA二十面體與單獨的藥物治療或不具有靶向功能的DNA二十面體相比，細胞內化程度提高，細胞毒性降低。Ding等[19]利用三角形和管狀DNA折紙納米結構作為阿霉素遞藥的載體，制備了負載阿霉素的DNA折紙結構，并將其應用于正常或阿霉素耐藥的人乳腺癌細胞株(MCF-7)。研究發現，DNA折紙納米載體增強了藥物在病變細胞中的積累，不僅對正常MCF-7細胞具有顯著的細胞毒性，而且對阿霉素耐藥的MCF-7細胞也具有顯著的細胞毒性。

放射性同位素锝-99m可以共價連接到單鏈DNA上，然后組裝到DNA納米結構中發揮其功能。Fan[20]等設計了多臂DNA四面體納米結構(TDNs)作為體內造影劑，可實現近紅外(NIR)熒光和單光子發射計算機斷層掃描(SPECT)的雙模態成像。他們將NIR染料Dylight-755與其中一條核心鏈共軛，并自組裝成TDNs結構。然后在TDNs的多臂ssDNA結構上修飾靶向配體葉酸和放射性同位素99mTc。雙標記TDNs探針實現了在細胞水平和動物水平NIR和SPECT雙模式成像的能力。采用NIR熒光成像技術，評價了TDNs在小鼠體內的藥代動力學，與單鏈DNA相比，其體內生物分布和循環時間明顯不同。

3 功能核酸類藥物的遞送研究

具有獨特生物醫學功能的核酸能夠通過堿基互補配對的方式與DNA納米載體結合。幾種功能核酸，如CpG序列、反義序列、siRNA、miRNA等，均已被設計成DNA納米結構[21]。如Fan等[22]設計了一種含有CpG序列的DNA四面體，用簡單的退火程序就可將四條DNA鏈(含四面體組裝的核心序列和CPG序列)組裝成DNA四面體結構。與游離CpG序列相比，負載了CpG序列的四面體具有較好的穩定性，無需轉染試劑即可有效地被巨噬細胞RAW264.7細胞攝取。在TLR9識別后，含CpG的四面體可使腫TNF-α、IL-6和IL-12等促炎細胞因子的表達升高，顯示了納米結構的有效免疫刺激作用。Rehberg[23]等研究了裝載了CpG序列的DNA納米管在體內對免疫細胞的影響。采用單鏈Tiles(SST)方法設計了8螺旋DNA納米管，并通過CpG基序對每個管中的24個Tiles進行了擴展。與其他DNA納米載體相似，負載了CpG的DNA納米管在巨噬細胞中表現出TNF-α反應。將DNA納米管注射到麻醉小鼠的骨骼肌中，用體內顯微鏡觀察到DNA納米管被組織駐留的巨噬細胞內化。與未載藥的DNA納米管或游離的CpG不同，裝載了 CpG的DNA納米管招募大量白細胞進入肌肉組織，并激活周圍細胞中的NF-κB通路，表明DNA納米管是靶向組織巨噬細胞的有效運載工具。 Anderson[24]等設計了裝載siRNA的多功能DNA四面體結構，可用于體內靶向治療。DNA四面體納米粒子可以將siRNA傳遞到腫瘤細胞中，并下調靶基因。在小鼠腫瘤模型中，葉酸修飾的DNA四面體納米粒子比單獨的siRNA(t1/2≈6min)具有更長的血液循環時間，和穩定的基因沉默效果。

4 蛋白多肽類藥物的遞送研究

DNA納米結構可通過特異性反應與蛋白質或多肽相結合，已廣泛用于相關藥物遞送。Yan[25]等人在DNA四面體納米結構中同時組裝了抗原(鏈霉親和素分子)和免疫佐劑(GpG)。與抗原和CpG分子的混合物相比，共組裝的DNA四面體(抗原佐劑復合物)在體內觸發了強烈、特異和持久的免疫反應，而不會對DNA支架本身產生不良反應。Chen[26]等最近報道了滾環擴增(RCA)驅動的DNA-RNA納米膠囊，將CpG、Stat3短發夾RNA佐劑和腫瘤特異性肽作為納米疫苗用于協同癌癥免疫治療。RCA過程將CpG和shRNA結合在一起，然后自組裝成DNA-RNA納米膠囊。經PPT-g-PEG修飾后，DNA-RNA納米粒子通過疏水相互作用進一步負載腫瘤特異性肽作為協同納米疫苗，DNA-RNA納米膠囊在淋巴結(LNs)中被遞送給抗原提呈細胞(APC)，引起有效和持久的抗原特異性T細胞反應，并抑制腫瘤的進展。

5 智能響應型DNA納米遞藥系統

具有刺激響應特性的天然大分子在生物系統中發揮各種重要作用。這些自組裝生物分子在動態條件下工作，可對微妙的生物變化做出反應，以實現其功能。在自然生物大分子系統的啟發下，分子尺度上的人工系統或機器的自下而上的設計、建造和操作是納米科學和技術中的熱門話題。其中，DNA分子已被證明可在感知、激活和響應中發揮關鍵功能，DNA納米技術也從結構研究擴展到功能方面的研究，智能響應型DNA納米遞藥系統應運而生，且已取得了豐碩的研究成果。響應因子在響應型遞藥系統中起重要作用，目前智能響應型DNA納米遞藥系統主要可分為pH、光、溫度、特異性酶和mRNA響應這幾類[27]。如Kim等[28]人將富含胞嘧啶的i-motif結構域設計在四面體的一個邊上，設計了可pH響應的DNA四面體結構。在正常pH下DNA四面體裝載的蛋白可以免受蛋白酶的影響，但在腫瘤區域，富胞嘧啶的邊在酸性pH下通過形成i-motif結構而被破壞，裝載的蛋白從四面體中暴露出來并被激活。我們課題組利用腫瘤細胞端粒酶特異性表達的特性，設計了端粒酶響應型DNA二十面體結構。我們將端粒酶的響應序列和引物序列設計到DNA二十面體結構的序列中，同時裝載鉑納米藥物。實驗發現，該DNA二十面體結構只針對端粒酶特異性表達的腫瘤細胞釋藥，在正常細胞內結構穩定。很好的實現了腫瘤細胞響應性釋藥，避免了對正常細胞的毒性[29]。

6 展望

盡管DNA納米結構在藥物遞送方面已取得廣泛應用，但目前還未有相關藥物上市。所以其發展趨勢應該以實際應用為出發點，首先應該闡明DNA納米結構的細胞內吞機制、細胞內命運、藥物動力學(即體內循環、分布、代謝、排泄等)。及研究它們的細胞內行為與這些結構物理/化學性質(例如幾何形狀、表面電荷、堿基組合)之間的關系。此外，DNA納米結構的高純度制備和大規模生產也是影響其應用的巨大挑戰，這是實際生物醫學應用的必要條件。目前也有研究在解決這些問題。如Shih等開發了瓊脂糖凝膠分離，用于純化高產率的DNA折紙納米結構。相信在研究人員的不斷努力下，DNA納米結構在藥物遞送方面定能取得更大的進步。