社區獲得性呼吸窘迫綜合征毒素與肺炎支原體感染喘息的關系研究進展

林詩惠綜述 歐維琳審校

肺炎支原體(MP)是引起呼吸道感染的常見病原，3～15歲兒童的社區獲得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)中8%～40%由MP感染引起，MP呼吸道感染臨床表現呈多樣性，可以從無癥狀到鼻咽炎、鼻竇炎、中耳炎、咽扁桃體炎、氣管支氣管炎、細支氣管炎和肺炎等。喘息是MP所致細支氣管炎的主要表現，嬰幼兒支原體肺炎(MPP)者喘息癥狀較年長兒明顯。MP 感染還與哮喘樣急性發作相關，有31%～50%MP感染者會出現哮喘樣急性發作[1]。MP感染的致病機制尚未完全明確，已經發現MP的P1和P30黏附蛋白具有直接細胞毒性反應，內源性活性氧及過氧化物、脂蛋白也是重要毒力因素。近年來研究發現，社區獲得性呼吸窘迫綜合征毒素(CARDS TX)是MP表達的一種新型毒力蛋白，在MP致病機制中發揮著主要作用，本文從CARDS TX的結構功能、致病機制方面與MP感染相關性喘息研究進展進行綜述。

1 CARDS TX概述

2005年kannan等[2]在研究各種宿主蛋白作為支原體表面寄生的靶點時，發現了一種名為MPN372的支原體多肽，它具有ADP-核糖體化(ADP-ribosyltransferase，ADP-RT)和空泡化活性，并將其命名為CARDS TX。它可以與肺表面活性劑的主要成分表面活性蛋白A(SP-A)和膜聯蛋白家族成員中的AnxA2(Annexin A2)結合，并利用網格蛋白內吞機制進行內化，發揮一系列的細胞毒性作用。

2 CARDS TX的結構功能

2.1 CARDS TX的分子結構 CARDS TX 由17個α螺旋和43條β鏈組成，具有功能上可分離的N-末端和C-末端結構域。N-末端的D1結構域(D1)和C-末端的D2、D3結構域(D2、D3)折疊成等腰三角形排列。

2.1.1 CARDS TX的N-末端結構域：CARDS TX 的N-末端為單抗ADP核糖轉移酶(mono-ADP ribosyltransferase，mART)，具有與NAD結合能力和ADP-RT活性。研究發現[3]，CARDS TX通過與NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)炎性反應體共定位，并催化NLRP3的ADP-核糖化來激活NLRP3炎性反應體，釋放IL-1β。IL-1β決定了一系列炎性相關疾病炎性反應的嚴重程度，還可加重變態反應性疾病，如過敏性哮喘[4-5]。載脂蛋白E(ApoE)通路可通過抑制NLRP3炎性小體的激活和氧化應激而負向調節過敏性氣道炎性反應，靶向ApoE通路可能是治療哮喘等過敏性氣道疾病的新途徑[6]。CARDS TX與N端肽結合可產生功能性IgE誘導肥大細胞脫顆粒，引發哮喘樣疾病[7]。

2.1.2 CARDS TX的C-末端結構域：CARDS TX C-末端的β-三葉結構域與CARDS TX的細胞表面受體識別、結合及內化有關，并且C-末端區域以類似全長毒素的方式誘導空泡化。研究數據表明[8]，CARDS TX與磷脂酰膽堿(PC)和鞘磷脂(SM)的結合能力高于其他膜脂，將C-末端的20個殘基截斷后發現，這種特異性結合功能消失，這說明受體的結合部位位于D3。C末端除了具有致細胞空泡化、ART活性的必要結構，還具有多個抗原表位，使CARDS TX具有較強的免疫原性。

2.2 CARDS TX的氨基酸結構 CARDS TX是一種由591個氨基酸組成的毒力因子，與百日咳毒素(PT)的S1亞基(PT-S1)和霍亂毒素(CT)的催化結構域有同源性。這3種毒素的mART結構域都具有DT亞組(CTxg)ADP核糖基化毒素的特征性R-STS/T-E信號基序。N-末端的精氨酸(R10)和中間區絲氨酸—蘇氨酸—絲氨酸(S49-T50-S51)氨基酸序列與NAD+定向結合，而催化性谷氨酸(E132)負責轉移酶活性。但CARDS TX ADP-RT序列卻不同于其他細菌的mART結構域，94-126殘基形成螺旋鏈構成D1。因此，CARDS TX除了具有ADP-RT活性外，還可誘導細胞空泡化、黏膜細胞脫落和纖毛喪失。野生型(WT)和半胱氨酸到絲氨酸突變型CARD毒素的硫醇實驗發現，半胱氨酸氨基末端殘基C230和C247形成了二硫鍵(DT)，DT對CARDS TX的構象穩定性和功能活性的保存至關重要[9]。

3 CARDS TX的致病機制

3.1 參與細胞膜表面黏附 細胞黏附是MP定植的關鍵步驟。CARDS TX可以與SP-A和AnxA2結合，使MP黏附于宿主細胞。在同時表達AnxA2和SP-A的NCI-h441細胞轉染AnxA2 siRNA后，AnxA2和SP-A的表達明顯減少，并且發現CARDS TX的結合能力及細胞空泡化作用與AnxA2及SP-A的表達呈正相關。研究表明，SP-A比AnxA2的表達更占優勢，SP-A更易于作為結合靶標。但AnxA2作為CARDS TX結合和內化的獨特受體，CARDS TX可選擇性地與AnxA2結合，并在內吞和轉移的早期階段調節膜動力學，增強CARDS TX的空泡化作用，且AnxA2抑制劑可阻斷此過程。MP感染后寄生在呼吸道黏膜表面，并繁殖于黏膜細胞，可釋放過氧化氫和核酸酶等物質，誘導纖毛退化及葡萄糖代謝、氨基酸攝取和蛋白質合成的生化損傷，造成呼吸道上皮細胞壞死、病變等[10]。此外，P1黏附素介導的細胞黏附在MP中具有獨特性[11]。

3.2 內化至細胞內 CARDS TX必須與宿主受體細胞AnxA2和SP-A受體結合后，利用網格蛋白介導途徑內化，然后轉運到特定的細胞內才能發揮ADP-RT和空泡化活性。其內化方式與白喉毒素(diphtheria toxin，DT)類似，毒素被翻譯成一個單一的多肽鏈，通過網格蛋白途徑被內吞。CARDS TX在內化作用時可產生氧自由基導致細胞損傷和結構惡化。

3.3 細胞內運輸 CARDS TX從早期內涵體運輸到晚期內涵體，然后利用其獨特的KELED序列通過逆向運輸(高爾基體中間室到達內質網)以發揮毒素的致病作用。CARDS TX的逆向轉運對NLRP3 ADP-RT介導的IL-1β分泌及誘導之后的液泡形成至關重要。KELED序列位于D1和D2、D3結構域之間的接頭處。研究發現[8]，D1與D2、D3之間主要是極性連接，表明該界面可以被破壞，這能否成為靶向治療位點有待研究。

3.4 誘導細胞內空泡化 CARDS TX誘導的特征性空泡化可導致纖毛運動減退和呼吸道上皮細胞完整性喪失，引起細胞死亡。CARDS TX誘導形成的泡液與幽門螺旋桿菌Vac A均呈酸性，但Vac A需要在酸性或弱堿存在下才能誘導酸性空泡形成[12]，CARDS TX則不需要。研究還發現，CARDS TX的泡液來源于晚期內涵體，通過GTP結合蛋白Rab9(Rab9 GTPases)介導內吞途徑實現空泡化作用。液泡ATP合成酶(V-ATPase)抑制劑bafilomycin A1和離子載體monensin可通過阻止早期內涵體的內吞途徑抑制液泡的形成。AnxA2不僅介導CARDS TX結合，而且還作為CARDS TX ADP核糖化和空泡化事件的關鍵介質。纖溶酶是一種具有促炎活性的蛋白酶，氣道平滑肌(ASM)細胞可將纖溶酶原裂解成纖溶酶。纖溶酶原以AnxA2調節的方式刺激ASM細胞因子的產生，在哮喘病理生理學中具有重要意義，靶向AnxA2介導的信號轉導可能為治療慢性哮喘等疾病的氣道炎性反應提供一種新的治療方法。

4 CARDS TX與MP感染喘息的關系

氣道炎性反應是喘息性疾病發生的本質，而過度炎性反應是MP所致兒童呼吸道感染的病理生理基礎。與SP-4肉湯培養相比，CARDS TX mRNA的表達量在哺乳動物中明顯增高。CARDS TX可以解釋MP感染相關的細胞病理學和炎性反應[13]，并且與MP感染喘息的發病、發展及喘息持續狀態存在關系。

4.1 CARDS TX與MP感染喘息的發病相關 MP是嬰幼兒喘息最常見的病原體之一，初發喘息和反復喘息的患兒MP感染率和血清IgE水平均顯著高于非喘息患兒[14]，這表明MP感染與嬰幼兒喘息密切相關。Medina等[7]發現，CARDS TX足以在BALB/CJ小鼠中誘導哮喘樣疾病，其發病機制是CARDS TX通過Balb/C信號通路產生IgE，發生肥大細胞脫顆粒，導致氣道高反應性。Ye等[15]研究認為，產生這種過敏原特異性IgE是MP的黏附素P1蛋白，P1特異性IgE陽性的MP肺炎患者體內表現為IL-4、IL-13、CCL17和CCL22的表達增加，Th0細胞過度分化為Th2細胞。這表明針對蛋白質的抗體對宿主防御肺炎支原體很重要，也對靶向疫苗的開發具有重要的作用[16]。總之，CARDS TX在體內具有高免疫原性表位，可引起嗜酸性粒細胞增多，T細胞和B細胞積聚，產生相應的自身抗體，同時釋放各種細胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ (IFN-γ) 及多種白介素(IL)，包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13和IL-17等細胞因子[17-18],對T細胞亞群Th1/Th2比例產生破壞，表現為Th2細胞炎性反應增強，導致黏液化生和氣道高反應性增加，肺功能下降，以氣道阻力增加和肺順應性降低為特征。

4.2 CARDS TX與MP感染喘息的加重相關 有學者用CARDS TX抗原捕獲PCR和P1黏附素PCR反應來檢測MP，以評價哮喘患兒體內MP的抗體反應及對哮喘控制情況的影響。研究發現，MP的檢出率與哮喘病情加重有關，并且推測，這可能與哮喘患兒對MP的體液免疫應答較差有關，導致急性哮喘患兒有較高的MP感染率[19-20]。持續MP感染可產生大量CRP、乳酸脫氫酶(LDH)、鐵蛋白等炎性標志物，可加重喘息性疾病，且CRP、LDH和黏液栓的存在，與難治性MPP患兒胸片浸潤影的消失時間有關[21-22]。氣道內MP水平較高時(MP高負荷)，其患兒的肺外表現、肺實變、胸腔積液及過敏史、空氣變應原試驗陽性、血清IgE、ECP升高的比例均明顯升高，表現為肺泡灌洗液(BALF)中IL-4水平明顯升高[23]。一項對Th17與MPP關系的研究得出，過度的Th17細胞反應可能是持續感染期間免疫病理損傷的原因，miR-29c/B7-H3/Th17軸在MPP患兒過度炎性反應中起重要作用[24]。哮喘患兒病情加重與IgM水平直接相關，有MP抗體IgM陽性的哮喘患者顯著增加了1年再入院的機會，并且CARDS TX IgM 向IgG的轉換過程中，不僅加強了CARDS TX在氣道感染期間的合成和檢測，而且提高了CARDS TX引發強烈免疫原性反應的能力[25]。以上均可能是MP感染與喘息性疾病加重密切相關的原因。

4.3 CARDS TX與MP感染喘息持續狀態密切相關 MP可以在呼吸道中存在較長時間，即使在使用適當的抗生素治療后，MP仍會在呼吸道中持續數月并保持傳染性，這與發展為喘息持續狀態密切相關。單次暴露于CARDS TX足以在體內引起長時間的過敏性炎性反應，并且炎性峰值的時間與CD4+T細胞相關的肺順應性下降程度有關聯，MP感染的哮喘患兒在穩定期氣道T淋巴細胞免疫功能明顯下降，表現為CD4+/CD8+比值顯著降低，這可能與哮喘在MP感染后出現喘息持續狀態有關[26-27]。并且，低水平的MP無法有效地誘導PGE2而下調過敏反應，從而維持甚至加重哮喘氣道的過敏性炎性反應。研究發現[28-29]，MP可在病原體表面形成一層生物膜，隨著生物膜的成熟，CARDS TX水平下降，但耐藥性也隨之增加，更不容易被抗生素抑制和補體殺傷。在難治性哮喘患兒呼吸道分泌物能檢測到CARDS TX，相對于CARDS TX陰性的患兒疾病難以控制，生活質量較差。此外，TNF-α也與持續復發性喘息風險密切相關[30]。韓國一項觀察性研究發現[31]，只有一小部分患兒在MPP后出現反復喘息發作(RWE)，RWE患兒在初次MP感染時出現喘息的可能性更大，然而在MP肺炎流行期住院的RWE患兒并沒有增加，這是因為MP再感染在兒童中很少見，包括反復喘息發作的患兒或哮喘患者。

綜上所述，CARDS TX作為MP的致病毒素，一方面通過ADP-RT活性來激活NLRP3炎性反應體，引起一系列的炎性反應；另一方面利用毒素的空泡化作用引起纖毛運動減慢及呼吸道上皮細胞完整性的破壞，與喘息的發生、加重及持續狀態密切相關。對于結構功能方面與MP感染的喘息研究較少，仍需進一步研究，有望對MP感染伴喘息性疾病診治提供實驗室依據，對于MP感染相關性喘息的治療及研發CARDS TX的靶向藥物提供新的思路。