雞傳染性支氣管炎病毒檢測方法的初步探討

錢 坤，李春青

（天津市農業生態環境監測與農產品質量檢測中心 300402）

雞傳染性支氣管炎是由雞傳染性支氣管炎病毒所引發的一類高度接觸傳染性、急性、病毒性呼吸道病變。 該疾病于全球范圍內廣泛分布，是一類嚴重威脅全球養殖業的重大傳染疾病。

病禽的主要特征為氣管啰音、打噴嚏、咳嗽等等[1]。 在發病之后，會侵害病禽的泌尿生殖系統、呼吸系統、消化系統等等。 該疾病的死亡率較高，會引起小雞死亡。 成年產蛋雞群感染之后，會導致產蛋量降低，體質下降，另外還會導致受到感染的幼雞群增重以及飼料報酬顯著下降。 特此，本文全面分析雞傳染性支氣管炎病毒RT-PCR 檢測方式的有效性，現將具體結果報告如下。

1 病原

IBV 歸屬于冠狀病毒科， 致病性較為復雜， 有著多種血清型。 在中國，雞傳染性氣管炎具體的流行株為Gray 株、Hotle 株、Mass 株以及T 株。另外也存在大量的變異菌株。臨床診斷可將其分為腸型、腎型、腺胃型以及呼吸型等幾類。 值得說明的是，單純憑借臨床解剖通常無法獲得詳細病因， 所以說有必要取得實驗室檢測結果。 和以往相比，當前我國分子生物學技術有所進展。在這種情況之下， 國內諸多學者依然將RT-PCR 技術應用于IBV 病毒檢測之中。

IBV 屬于不分節段單股正鏈RNA 病毒。 其中因mRNA4 編碼病毒膜蛋白為一類跨膜蛋白。 其屬于IBV 粒子內含量最高的糖蛋白類別。于IBV 裝配成熟整體過程中，起到了不可代替的作用。

2 IBV 病毒RT-PCR 檢測具體方法

2.1 IBV 病毒RNA 提取步驟

第一，IBV 病毒RNA 提??；第二，IBV 病毒DNA 提取。

2.2 RT-PCR 反轉錄聚合酶鏈式反應相關步驟

第一，RT 利用20μL 體系予以完成；第二，M 基因擴增利用50μl 體系予以完成。

在此之后實施特異性鑒定以及敏感性鑒定。

特異性鑒定利用所創建的PCR 方法有效擴增相關病毒測定該類方法的特異性。 回收IBV RT-PCR 電泳條帶， 并和pMD18-T 載體相連，處理轉化感受態DH5α。 鋪氨芐抗性LB 瓊脂平板，在37℃環境之下倒置培養處理，經過鑒定之后擇取陽性菌落，實施擴大培養后進行測序。

敏感性測定具體方式為：依照RT 的制備方法，制備出IBVM-cDNA。 在此之后，實施十倍比例稀釋。 取用2μL，將其視為模板。 在其余條件穩定情況之下，開展PCR 檢測擴增。 將發生陽性反應條帶模板用量最高稀釋比例計算出最低IBV-M-cDNA 具體量[2]。

3 雞傳染性支氣管炎病毒RT-PCR 檢測方法取得的結果

雞傳染性支氣管屬于一種重大傳染病。 當前獸醫臨床上并無典型的病變特點，所以說診斷較為困難。 現如今，常規化測定IBV 病毒實驗室方法包含血清學、 病原學以及分子生物學方法。以上方式存在一定弊端， 有的方法進行時間達到幾天以至于數周，比如說動物接種；有的需要較高細菌培養條件，比如血清中和試驗[3]；而有的方法則存在非特異性反應以及敏感性低等等缺陷。

利用PCR 為核心的分子生物學檢測方法，于IBV 早期診斷中能夠取得滿意效果。 和常規性血清學檢測技術相比，這種方法的優勢更多。 能夠直接把病毒基因視為研究目標，繼而更為精準可靠的鑒定病毒種類。 同時也有助于判斷病毒流行病學情況。

有實驗依照已經發表的IBV-M 基因序列內設計了一對具有特異性的引物。 其有著敏感性好、特異性高的特點。 創建出快速簡便的RT-PCR 檢測方式。 利用這種RT-PCR，能夠從IBV 疫苗內擴增出目片段。 在相同的條件之下， 其余病毒諸如DHV、DRV、NDV 等等，均沒有出現擴增出目的片段。 并且所測量的M基因全序列和發表的Mass41 中的M 基因相一致。這也在一定程度上證實了這種PCR 擴增技術用于鑒定IBV 病毒有著良好的可靠性和特異性。 值得進一步推廣。