酶聯(lián)免疫吸附試驗及注意事項

張曉亭，宋琳琳，秦百眾

（1.許昌市建安區(qū)動物疫病預防控制中心 461000；2.平輿縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 463400）

免疫抗體檢測作為評估重大動物疫病疫苗免疫評估效果最直接的手段，對于養(yǎng)殖業(yè)來說具有很重要的意義。 而傳統(tǒng)的抗體檢測方法如針對禽流感、新城疫的血凝與血凝抑制試驗，針對布魯氏菌病的虎紅與試管凝集試驗，費時費力，且容易出現(xiàn)假陽性假陰性的結(jié)果，隨著檢測技術的不斷進步，ELISA 憑借其特異性好、 靈敏度高等優(yōu)點逐漸成為動物疫病防控中疫苗免疫抗體檢測的主力軍。

1 基本原理

將已知的抗原或抗體結(jié)合于固相載體表面，并保持抗原或抗體的免疫活性。 將抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，同時保持酶的活性與抗原或抗體的免疫活性。 在檢測時，將待檢血清樣品與酶標抗原或抗體按不同的步驟加入反應板，使之與固相載體表面的抗原或抗體反應結(jié)合，洗滌去除其他雜質(zhì)，則最后結(jié)合在固相載體表面上的酶量與待檢血清樣品中的抗原或抗體量呈一定的比例。 加入底物，其所含的供氫體可在酶的作用下被還原為有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應。 故可通過顏色的深淺判斷待檢血清樣品中抗原或抗體的量。

2 分類

2.1 間接ELISA

間接ELISA 是將特異性抗原包被于固相載體表面，形成固相抗原，若待檢血清樣品中存在抗體則與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物，洗滌去掉血清中的雜質(zhì)與其他免疫球蛋白，只留下固相抗原抗體復合物，加入酶標抗體，與固相抗原抗體復合物中的抗體結(jié)合，洗滌去掉未反應的酶標抗體，洗滌后的固相載體上的酶量就代表待檢血清樣品中抗體的量。 加入底物與酶結(jié)合顯色，顏色深代表待檢血清樣品中抗體量多；顏色淺代表待檢血清樣品中抗體量少。

2.2 競爭或阻斷ELISA

競爭或阻斷ELISA 是將特異性抗原包被于固相載體表面，形成固相抗原，待檢血清樣品中存在抗體則與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物， 再加入酶標抗體與之競爭結(jié)合特異性抗原，（或者是用酶標抗體阻斷特異性抗原與待檢血清樣品中抗體相結(jié)合），加入底物與酶結(jié)合顯色，顏色深代表酶標抗體結(jié)合的抗原量多而待檢血清樣品中的抗體結(jié)合的抗原量少， 即待檢血清中的抗體量少； 反之顏色淺代表酶標抗體結(jié)合的抗原量少而待檢血清樣品中的抗體結(jié)合的抗原量多， 即待檢血清中的抗體量多。

3 實驗操作注意事項

3.1 實驗前注意事項

3.1.1 移液器定期檢定、校準，確保加樣的準確性；酶標儀定期校正檢查濾光片，確保讀值的準確性；實驗前要檢查確保洗板機的每個針孔暢通無堵塞。

3.1.2 試劑盒中所有試劑包括反應板、血清樣品在使用之前應平衡至室溫（20℃～25℃）.

3.1.3 冷凍樣品使用前應混勻。

3.1.4 不同批次試劑盒的反應板、對照及酶標抗體等可能存在差異，故不能混用。

3.1.5 不用過期試劑盒，以免影響實驗結(jié)果。

3.2 實驗中注意事項

3.2.1 根據(jù)試劑盒的要求對血清樣品進行稀釋，注意稀釋倍數(shù)，注意陰陽對照需要稀釋與否，注意每種試劑的加樣量，加樣時注意要懸空加樣，做到不貼底，不貼壁。

3.2.2 注意實驗的孵育溫度，室溫孵育時要控制室內(nèi)溫度在20℃～25℃，且要避免在冷氣、陽光直射、熱源或通風口等溫度不均勻的地方實驗，且不能把反應板直接放在冰冷的實驗桌面。 當室溫較低時，建議在25℃恒溫箱內(nèi)進行實驗的孵育步驟。

3.2.3 洗板過程中要避免漏液、溢液現(xiàn)象，若同時做兩個及以上實驗，注意在洗板前更換洗液，洗板后要更換吸水紙輕輕拍干。

3.2.4 所有試劑一經(jīng)倒出，切忌不可再倒回試劑瓶內(nèi)，以防污染。

3.2.5 加入底物后應立即避光顯色，若實驗需要兩種底物混合使用，則需現(xiàn)用現(xiàn)配。