組織來源不同的間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及COPD 治療的研究進(jìn)展

周斌林，熊麗嬌 綜述；曾治平* 審校

（1.江西省贛南醫(yī)學(xué)院，贛州 341000；2.江西省贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，贛州 341000）

慢性阻塞性疾病 (chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是普遍存在、可及時預(yù)防、及時治療的呼吸系統(tǒng)慢性疾病,是以小氣道結(jié)構(gòu)和（或）肺泡異常引起持續(xù)性氣流受限并進(jìn)行性加重為主要特征[1]。 現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病已逐漸成為了重要的公共衛(wèi)生安全問題,根據(jù)GBD（全球疾病負(fù)擔(dān)）研究,從1990 年到2013 年,COPD 從全球疾病負(fù)擔(dān)的第八位上升到第五位[2]，且相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計,僅在2017 年,COPD 在中國和美國地區(qū)造成1135.2 萬死亡人數(shù),占當(dāng)年全球COPD 死亡總?cè)藬?shù)的三分之一[3]。COPD 的發(fā)病率及死亡率因持續(xù)暴露于COP D 危險因素及全球社會人口結(jié)構(gòu)改變正逐步升高，預(yù)計到2020 年將上升為全球致死疾病的第三位[4]。 目前COPD 嚴(yán)重危害人類健康，雖采用現(xiàn)有的各種治療措施如家庭氧療、糖皮質(zhì)激素、支氣管擴(kuò)張劑等治療措施可有效緩解氣道炎癥,提高生活質(zhì)量, 但并不能有效預(yù)防疾病進(jìn)展或修復(fù)肺結(jié)構(gòu)/肺功能[5]。 隨著對間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSC） 研究的不斷深入，MSCs 已成為當(dāng)前治療慢性阻塞性肺疾病一種潛在新的有效治療手段。 不同組織來源的MSC 的增值、分化、免疫表型及免疫調(diào)節(jié)活性等生物學(xué)特性在多方面不僅存在差異，而且對患者治療效果有影響。 現(xiàn)主要將探討骨髓、脂肪、臍帶等不同組織來源的MSCs 生物學(xué)特性的差異及治療COPD 的相關(guān)研究進(jìn)展。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞是來源于不同的受體組織或不同器官的一種多能干細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞、骨髓、臍帶血及羊水， 而且具有分化為不同中胚層細(xì)胞譜系的特性[6]。 國際細(xì)胞治療學(xué)會和組織干細(xì)胞委員會根據(jù)三個基本標(biāo)準(zhǔn)化來定義間充質(zhì)干細(xì)胞：⑴在一個標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)基中充分黏附于塑料表面，⑵充分表達(dá)CD105、CD73、CD90 細(xì)胞表面標(biāo)志物，缺乏對造血細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45、CD79a、CD14、CD11b、CD19、CD11a 和 HLA-DR Ⅱ類分子的表達(dá)，⑶在體外可多向分化為骨細(xì)胞、脂肪組織細(xì)胞、軟骨組織細(xì)胞的能力[7,8]。 多項研究成果表明MSCs 不僅具有自我更新及向其它組織分化的能力，還對多種先天性或適應(yīng)性免疫細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，如可以抑制樹突狀細(xì)胞（DC）的自我分化及成熟、促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 型細(xì)胞極化、抑制自然殺傷細(xì)胞 （NK）、NKT 細(xì)胞、B 細(xì)胞、CDT 性細(xì)胞增殖及誘導(dǎo) Treg 性 T 細(xì)胞擴(kuò)增等[8-11]。 MSCs 的免疫調(diào)節(jié)作用主要是通過多種可溶性介質(zhì)的釋放經(jīng)旁分泌途徑參與[12,13]。 此外，Huaman 等[14]研究中發(fā)現(xiàn)MSCs 缺乏表面組織相容性復(fù)合體I 和II 及T細(xì)胞表面共刺激分子（CD40、CD80 及 CD86）的表達(dá)導(dǎo)致MSCs 免疫源性較低，可有效逃避免疫排斥反應(yīng)。這些特性使得MSCs 成為包括慢性阻塞性肺疾病在內(nèi)的多種疾病理想的治療細(xì)胞類型。

2 組織來源不同的間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性差異

2.1 分離和增殖 骨髓組織是分離多能MSCs 的主要組織來源并被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)及臨床研究。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (bone marrow-mesenchymal stem cells, BM-MSCs）的分離是一種創(chuàng)傷性相對較高的過程，在Turinetto 等[15]研究中發(fā)現(xiàn)骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量、壽命、分化及增值潛能與個體年齡呈負(fù)相關(guān)。 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Umbilical cord -mesenchymal stem cells, UC-MSCs） 和脂肪間充質(zhì)干 細(xì) 胞 （Adipose-derived -mesenchymal stromal cells, ASCs）可通過創(chuàng)傷較小、規(guī)模大、更安全的方法分離，在 Seo 等[16]和 Vanpham 等[17]研究中發(fā)現(xiàn)脂肪和臍帶組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可在長時間內(nèi)維持其生物學(xué)特性。 UC-MSCs 和ASCs 有望成為MSCs 的替代組織來源。 組織來源不同的間充質(zhì)干細(xì)胞在體外均可增殖培養(yǎng)， 但體外增值培養(yǎng)仍有差異。 Chen 等[18]在間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)UC-MSCs 增殖培養(yǎng)能力最強(qiáng)， 但Nakao等[19]研究中發(fā)現(xiàn)BM-MSCs 增殖培養(yǎng)能力最高，而ASCs 與 BM-MSCs 和 UC-MSCs 相比，ASCs 增殖能力相對較弱。 間充質(zhì)干細(xì)胞體外增值能力不同可能與不同細(xì)胞傳代數(shù)或起源組織內(nèi)的增殖力不同有關(guān)。

2.2 免疫表型 組織來源不同的間充質(zhì)干細(xì)胞均可表達(dá)典型間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型， 但不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型具有差異。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞高度表達(dá) CD49f （整合素 a6）和PODXL，而 ASCs 對 CD34 表達(dá)水平較高，且其他組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)較低的CD34，并且ASCs 高度表達(dá) CD49d(整合素 a4)、CD54(ICAM-1)[20]。 Chu 等[21]研究中發(fā)現(xiàn)免疫表型 CD36+/CD106-對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞有一定鑒別作用。 此外，不同組織來源的MSCs 的免疫原性表達(dá)程度水平不同。Alhattab 等[22]研究表明BMMSCs 的 HLA-DR 和 HLA-DBQ2 類及 HLA-C 類MHC 分子表達(dá)最高。 Huaman 等[14]研究中發(fā)現(xiàn) AS Cs 與 BM-MSCs 相比,ASCs MHC-I 和 MHC-II 基因和蛋白表達(dá)水平較低，提示ASCs 具有較低的免疫原性。 此外，Ma 等[23]研究中發(fā)現(xiàn) UC-MSCs 同樣具有較低的免疫原性。 這意味著骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞易引起適應(yīng)性免疫應(yīng)答， 不利于同種異體細(xì)胞移植及存活。

2.3 細(xì)胞因子 現(xiàn)有的研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞主要是通過多種可溶性介質(zhì)的釋放經(jīng)旁分泌作用發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。 大量實驗數(shù)據(jù)已表明不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的可溶性介質(zhì)不同。Ostanin 等[24]在分析不同組織來源的MSC 分泌可溶性介質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)BM-MSC 自發(fā)性產(chǎn)生可溶性介質(zhì)的水平較低，ASCs 自發(fā)性分泌更多的IFN-γ,IL-2,IL-1β,TNF-α,IL-4,IL-6,G-CSF,GM-CSF 和趨化因子,ASCs 表現(xiàn)為顯著的促炎、免疫調(diào)劑和刺激造血功能, 但在LPS 刺激下BM-MSC 分泌可溶性介質(zhì)明顯增加，ASCs 分泌水平無明顯提高。有研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌較高的IL-6、IL-10、TGF-β1、PGE、VEGF[19,25]。Dabrowski 等[26]研究中發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞比ASCs 分泌較高的TGF-β 和較低的 VEGF, 而 IL-6、IL-10、TNF-α、MMP-1、MMP-13 等細(xì)胞因子分泌水平兩者無明顯差異。此外，細(xì)胞因子分泌與免疫相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)，不同組織來源的MSC 免疫相關(guān)基因表達(dá)也有差異[10,11,22]。

2.4 免疫調(diào)節(jié)活性 大量研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)或體外均可對多種先天性和適應(yīng)性細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，但不同組織來源的MSCs 對免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)能力存在差異。 Ribeiro[27]等研究發(fā)現(xiàn)脂肪、骨髓、臍帶三種組織來源的MSC 在與PHA 刺激的單核細(xì)胞共培養(yǎng)時，三者均可有效抑制CD4、CD8T 細(xì)胞活化及對淋巴母細(xì)胞特征的獲取，其中ASCs 抑制作用更明顯，而與BM-MSCs 和ASCs 相比較，UC-MSCs 對B 細(xì)胞的活化及CD56NK 細(xì)胞的活化激活無明顯抑制影響。 Valencia 等[28]對來自同一供體的BM-MSCs 和ASCs 在與NK 細(xì)胞共培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)兩者對NK 細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子分泌、 活化受體及細(xì)胞毒性的免疫調(diào)節(jié)作用兩者之間無明顯差異，但ASCs 抑制樹突狀細(xì)胞分化的能力更強(qiáng)。 此外，另一項研究表明BM-MSCs 和UCMSCs 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向抗炎表型（M2 型）極化，而ASCs 對促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化無明顯調(diào)節(jié)作用[29]。Deng 等[30]研究中發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞還可通過分泌IL-6、HGF 誘導(dǎo)單核細(xì)胞向低表達(dá)共刺激分子CD14+CD1a-細(xì)胞分化，且該誘導(dǎo)單核細(xì)胞顯著表達(dá)IL-10。 間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性還與細(xì)胞傳代數(shù)有關(guān)。 ElSayed 等[11]研究中發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)中，BM-MSCs 早期傳代細(xì)胞促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2(抗炎)表型轉(zhuǎn)化，而晚期傳代細(xì)胞則促進(jìn)向M1（促炎）表型轉(zhuǎn)化，且晚期傳代細(xì)胞對CD4、CD8T 細(xì)胞增殖抑制作用減弱。Zhuang 等[31]研究中發(fā)現(xiàn)衰老的UC-MSCs 比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫抑制活性， 這可能與衰老的 UC-MSCs 中 HMOX-1、IL-10、IL-6 和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）等免疫抑制基因上調(diào)有關(guān)。

3 MSCs在COPD治療中的研究進(jìn)展

大量基礎(chǔ)研究及臨床前研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)、 促血管生成及促組織再生修復(fù)等生物學(xué)特性，并在移植物抗宿主病[32]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[33]、視網(wǎng)膜病[34]等疾病研究中取得令人鼓舞的結(jié)果。 間充質(zhì)干細(xì)胞治療COPD 在臨床前肺氣腫小鼠模型研究中被證實有效。 WenGu 等[35]在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療香煙誘導(dǎo)的肺氣腫小鼠模型中發(fā)現(xiàn)與對照組相比，BM-MSCs 處理的肺氣腫小鼠肺組織病理顯示炎癥浸潤及肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯改善。 Kennelly 等[36]研究中發(fā)現(xiàn) BM-MSCs 在彈性蛋白酶誘導(dǎo)的慢阻肺小鼠模型中同樣顯示MSC 治療后可減少肺泡損傷及肺內(nèi)膠原基質(zhì)堆積。 此外，F(xiàn)ukui 等[37]在彈性蛋白酶誘導(dǎo)的肺氣腫小鼠模型中證實ASCs 可分化為肺泡上皮細(xì)胞修復(fù)肺損傷及改善肺功能。

間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行了多項治療COPD 的臨床實驗。 Weiss 等[38]研究中納入了62 例中至重度的COPD 患者并接受了4 次MSC 輸注， 并在第一次輸注后隨訪2 年，結(jié)果顯示MSC 組27 名患者和安慰劑組28 名患者出現(xiàn)不良事件， 其中MSC 組10例，安慰劑組8 例發(fā)生嚴(yán)重不良事件，但大多數(shù)不良事件報告為輕度，在 FEV、FEV 預(yù)測值、FVC、肺活量等方面兩組無顯著統(tǒng)計學(xué)差異， 但MSC 組循環(huán)CRP 早期較基線水平下降。 Oliveira 等[39]研究中招募了10 例重度肺氣腫患者并分為EBV（單向支氣管瓣植入術(shù)）+MSC（實驗組）和EBV+生理鹽水（對照組），進(jìn)行90 天的隨訪，在MSC 注射期間未觀察到嚴(yán)重或顯著的臨床癥狀及體征， 其中實驗組和對照組分別發(fā)生2 例和3 例不良事件， 兩組患者的肺功能 （如：FEV、FVC、FEV/FVC、TLC）、體重指數(shù)和6min 步行實驗結(jié)果顯示無明顯差異，但EVB+MSC 組循環(huán) CRP 在第 30、90 天較基線水平顯著下降。 Stolk 等[40]研究中招募了10 名重度肺氣腫患者并進(jìn)行2 次肺減容手術(shù)， 在第一次肺減容手術(shù)時分離BM-MSCs 并進(jìn)行體外擴(kuò)增，在第二次手術(shù)前3 周和4 周分別進(jìn)行靜脈輸注BM-MSCs，并在最后一次BM-MSCs 輸注后3 周內(nèi)進(jìn)行評估，結(jié)果表示在輸注48 小時內(nèi)及3 周內(nèi)均未出現(xiàn)癥狀或毒性反應(yīng)， 且該研究還采用免疫組化及PCR技術(shù)分析了兩次手術(shù)后的肺組織， 結(jié)果顯示經(jīng)BM-MSCs 輸注后， 肺泡間隔的內(nèi)皮標(biāo)志物CD31的表達(dá)增加了 3 倍， 證明MSCs 可誘導(dǎo) CD31 表達(dá)，而CD31 在內(nèi)皮細(xì)胞遷移及血管生成中扮演重要角色，此外，隨訪1 年后，F(xiàn)EV 較基線增加了(390±240)ml，殘氣量減少了(540±145)ml，所有患者的體重平均增加了4.6kg， 其可能是肺減容術(shù)及間充質(zhì)干細(xì)胞治療綜合作用的結(jié)果，然而，臨床上應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞治療COPD 是否可改善肺功能尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。 綜上所述，在COPD 患者進(jìn)行多劑量間充質(zhì)干細(xì)胞治療似乎是安全的、 可行的，并可減少炎癥反應(yīng)，這些研究結(jié)果為臨床上應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞治療COPD 提供重要依據(jù)。

4 結(jié)論

現(xiàn)在大量研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞治療COPD是安全、可行的，但同時需要考慮不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在分離和增殖、 免疫表型、 細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)功能等生物學(xué)特性方面存在差異。 骨髓組織現(xiàn)為間充質(zhì)干細(xì)胞提取的主要組織來源，但骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提取創(chuàng)傷大，提取細(xì)胞數(shù)量、增殖能力受年齡影響， 其免疫調(diào)節(jié)能力與細(xì)胞傳代數(shù)有關(guān)。 脂肪和臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞來源豐富，容易獲取，免疫原性相對較低，利于細(xì)胞移植及存活等優(yōu)點(diǎn)，使其成為理想的替代組織來源，但是否適應(yīng)體內(nèi)的環(huán)境仍需要進(jìn)一步研究。 因此我們可以根據(jù)不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性差異，選擇性的服務(wù)于臨床，為今后臨床治療COPD 選取合適理想的種子細(xì)胞。