微生物發酵對鮮姜汁抗氧化活性的影響

楊雷鵬 郭京波

摘 要：以鮮姜汁為原料，經酵母W.anomalus J12-7發酵，研究其對生姜抗氧化活性的影響。以單因素實驗為基礎，選擇姜汁添加量、發酵溫度和發酵時間為自變量，以抗氧化活性的響應值，采用Box-Behnken Design響應面優化發酵工藝，確立最佳發酵條件。結果表明，在20mLPDA液體培養基中添加381μL鮮姜汁，接種1%種子液，28.7℃溫度下培養60h，發酵后姜汁總抗氧化活性較發酵前提高約63.67%。據此，為開發高附加值鮮姜產品提供新思路。

關鍵詞：鮮姜汁;發酵;抗氧化活性;響應面分析

中圖分類號：TB ? ? 文獻標識碼：A ? ? ?doi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2020.04.093

生姜，是姜屬植物姜（Zinggiber Ofcinale Rosc）的根莖。在日常生活中，主要作為一種常見的香辛料被廣泛使用。生姜中含有多種生物化學成分，包括揮發性的姜精油以及具有刺激性氣味的姜酚、姜辣素、姜酮等，具有抗氧化、清除人體內自由基，降血糖、降低膽固醇、抗炎、抑菌、抗腫瘤、抗過敏等功效。鮮姜汁是無硫鮮姜去皮洗凈后，研磨過濾而得到的金黃色半透明液體，有濃郁姜香味，充分保留生姜中的活性物質和獨特氣味，是天然的食品添加劑和防腐劑。但是由于鮮姜汁自身特有的姜辣味，加上鮮姜汁中高生物活性成分相對較少，難以富集和提取，限制了鮮姜汁的市場應用。目前，國內外對于生姜的研究，主要集中在提高生姜中高生物活性成分含量等的方面，通過一系列物理、化學等的實驗步驟，將生姜中低生物活性成分的物質（如姜酚）轉化為高生物活性物質（如姜烯酚），轉化效率較低，且成本高昂，而通過微生物發酵的方式提高生姜生物活性的相關研究目前仍處在起步階段，對于其研究相對較少。

酵母菌是傳統發酵工業的優良菌種之一，可以利用不同原料，在不同發酵條件下通過自身代謝合成人們生產生活所需的各種產物，如酒精、L-乳酸、α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶等，以及一些具有特殊功能的次生代謝產物，如異低聚麥芽糖等。近些年來，隨著人們對于微生物研究的持續深入，酵母菌作為工程菌，有望在未來在不斷拓展到化工、環保等其他領域。

本實驗以鮮姜汁為底物進行酵母發酵，通過單因素及響應面優化試驗，以酵母發酵鮮姜汁總抗氧化活性為指標，分析酵母發酵對于鮮姜汁抗氧化活性的影響，為高抗氧化活性鮮姜汁的市場開發以及天然生姜資源的利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

酵母菌株：W.anomalus J7-2，山西師范大學生物工程實驗室保藏;無硫生姜：購于臨汾市堯都區堯豐市場。

試劑：PDA培養基、瓊脂粉，北京奧博星生物技術有限責任公司;DPPH，ABTS，TPTZ、水溶性維生素E，北京伊諾凱科技有限公司;甲醇，冰醋酸，水合乙酸鈉，過硫酸鉀，天津市科密歐化學試劑有限公司;FeCl3·6H2O，天津市致遠化學試劑有限公司。（以上所有試劑，無特別說明外，均為分析純）。

實驗設備：電子天平，上海精科;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠;SW-CJ-2FD型超凈工作臺，上海博訊;HPX-9272 MBE型數顯電熱培養箱，上海一恒;5804R型高速冷凍離心機，德國基因有限公司;HH-6型數顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇榮華儀器制造有限公司;752N型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮮姜汁制備

取適量無硫鮮姜，去皮洗凈，晾干后切成小塊，混入少量石英砂，用研缽研磨成汁，400目紗布過濾后即得到生姜原液。將生姜原液與水按照1∶4比例進行稀釋，攪拌混勻后，將鮮姜汁置于冰箱中，4℃冷藏，備用。

1.2.2 酵母菌種活化及種子液制備

取上述W.anomalus J7-2酵母菌株，將其接種于PDA液體培養基中，28℃恒溫培養48h，將新活化的酵母菌株恒溫培養至生長對數期，控制OD600吸光值約為0.8±0.01。

1.2.3 發酵預處理

在20mL的PDA液體培養基中，接種1%酵母菌種子液，添加不同量的鮮姜汁（1：4）作為發酵底物，28℃恒溫培養48h，將發酵液移入離心管中，殘渣用2mL蒸餾水洗滌后移入離心管，6000r/min離心20min后取出，用醫用注射器吸取上清液各2mL，用蒸餾水定容至10mL，進行相關指標檢測;以PDA液體培養基中添加與實驗組相對應的鮮姜汁量作為空白對照。

1.2.4 酵母發酵鮮姜汁的單因素試驗

在20mLPDA中添加適量鮮姜汁，接入1%酵母種子液，選擇姜汁添加量、發酵溫度、發酵時間進行單因素試驗。采用控制變量法，固定發酵溫度為30℃、發酵時間為60h，向培養基分別添加不同量鮮姜汁，與酵母共發酵后測定總抗氧化活性（Total Antioxidant Capacity， TAC）;固定鮮姜汁添加量為360μL，發酵時間為60h，測定培養基分別在不同溫度梯度下發酵后的總抗氧化活性;固定姜汁添加量360μL，發酵溫度確定為30℃，測定培養基在不同培養時間下的總抗氧化活性。

1.2.5 酵母發酵鮮姜汁的響應面分析

以單因素試驗為基礎，選擇姜汁添加量、發酵溫度、發酵時間三者為自變量，發酵后姜汁的總抗氧化活性為響應值，使用Design-Export10.0軟件中Box-Behnken Design進行響應面優化方案設計，利用方差分析（ANOVA）進行實驗數據的模型擬合，根據實驗結果計算最高抗氧化活性及對應相關因素的最佳水平。

1.2.6 酵母發酵鮮姜汁的抗氧化活性評價

實驗通過測定發酵后培養液的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力以及Fe3+還原能力（FRAP），計算總抗氧化活性（TAC），單位為μmol TE/g Ginger juice。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 姜汁添加量對抗氧化活性的影響

在20mLPDA液體培養基中分別添加200μL、220μL、240μL、260μL、280μL、300μL、320μL、340μL、360μL、380μL、400μL鮮姜汁，接種1%種子液，28℃下發酵48h后測定總抗氧化活性。結果表明，在220-300μL姜汁添加量范圍內，隨著姜汁添加量的增加，總抗氧化活性無明顯變化;在320-360μL范圍內總抗氧化活性隨著姜汁添加量的增加而增加，在添加量為360μL時達到最大值，為3340.95±169.05μmol TE /g Ginger juice;當添加量大于360μL時，總抗氧化活性開始下降，可能是由于姜汁添加量過多，酵母生長受到抑制，從而抗氧化活性降低。因此選擇360μL姜汁添加量進行后續實驗。

2.1.2 發酵溫度對抗氧化活性的影響

在20mLPDA液體培養基中添加360μL鮮姜汁，接種1%種子液，分別置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃溫度下培養48h后測定總抗氧化活性。測試結果表明，隨著溫度的升高，姜汁的抗氧化活性逐漸增強;當培養溫度為30℃時，姜汁抗氧化活性最強，達到4759.72±237.99μmol TE /g Ginger juice;當溫度高于30℃后，姜汁抗氧化活性明顯下降，說明該溫度下酵母代謝受到抑制，導致總抗氧化活性下降。因此選擇30℃作為發酵溫度進行后續實驗。

2.1.3 發酵時間對抗氧化活性的影響

在20mLPDA液體培養基中添加360μL鮮姜汁，接種1%種子液， 30℃溫度下分別培養12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h后測定總抗氧化活性。結果表明，在姜汁添加量為360μL，30℃培養時，隨著發酵時間的增加，姜汁總抗氧化活性不斷增加;當發酵時間為60h時，姜汁總抗氧化活性最高，達到3530.52±176.53μmol TE /g Ginger juice;當發酵時間超過60h后，總抗氧化活性變化不大，原因可能是由于酵母在發酵到60h之后，酵母總體生長平緩，并開始進行酒精發酵。因此，選擇發酵時間為60h進行后續實驗。

2.2 W.anomalus J12-7發酵鮮姜汁響應面分析

根據單因素實驗結果，選擇姜汁添加量（X1）、發酵溫度（X2）、發酵時間（X3），利用Box-Behnken Design進行三水平三因素的響應面優化方案設計，即將上述17組實驗的抗氧化活性測定結果輸入到Design-Export軟件中，進行回歸方程模型的建立，經過分析后認為，該實驗的回歸方程模型為：TAC=4004.95+110.61X1-99.94X2+63.84X3+68.81X1X2+106.24X1X3-40.97X1X3-1111.40X12-371.63X22-136.80X32。該回歸方程表示過W.anomalus J12-7發酵后，鮮姜汁總氧化活性（TAC）與三個自變量之間所存在的函數關系。

對該優化試驗方案進行方差分析后認為，該優化實驗設計模型的回歸效應極顯著（P<0.01），回歸方程置信度高達99.9%;失擬項不顯著（P=0.0751>0.05），表明模型擬合程度較好;復相關系數R2=0.9895，表明實驗數據與該模型符合程度較高;AdjR2=0.9760，表明模型可以用來對實驗結果進行準確預測。

根據模型所給出的理論最優組進行實驗，將優化后測得的結果與優化前所測抗氧化活性最高組進行比較，得出W.anomalus J12-7發酵鮮姜汁的最優工藝參數為：姜汁添加量381μL、發酵溫度28.7℃、發酵時間為60h，總抗氧化活性為4324.27±216.21μmol TE /g Ginger juice。

3 結論

本文主要通過W.anomalus J12-7酵母菌發酵鮮姜汁，測定發酵后姜汁的抗氧化活性;通過單因素試驗及響應面優化確定W.anomalus J12-7的最佳發酵條件為：20mLPDA液體培養基中添加381μL鮮姜汁，接種1%種子液，28.7℃溫度下培養60h，發酵后的姜汁總抗氧化活性較發酵前提高約63.67%。結果表明，W.anomalus J12-7可以有效提升鮮姜汁的抗氧化活性，改善發酵風味，在食品工業中，可用于生產具有高抗氧化活性的生姜保健黃酒及其一系列高附加值產品。

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