油桐生物學研究進展

張慶偉，溫智婷，羅克明

（西南大學 a.生命科學學院；b.三峽庫區(qū)資源與環(huán)境教育部重點實驗室； c.重慶市資源植物保護與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，重慶 400715）

油桐Vernicia fordii為大戟科油桐屬落葉喬木，原產(chǎn)我國，種植范圍比較廣，在我國已有上千年的栽培歷史[1]。油桐種子富含油脂，稱為桐油，是植物油中最優(yōu)質(zhì)的干性油，具有干燥快、附著力強、比重輕、富光澤、耐酸、耐堿、耐高溫、抗凍裂、防水、防腐、絕緣、抗輻射、抗?jié)B透等優(yōu)良特性，被廣泛用作兵器、車船、電子、電器、建筑、裝飾、機械、漁具等的環(huán)保型涂料[1-2]。隨著人們環(huán)境意識和健康意識的增強，環(huán)保型油漆已成為油漆產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要趨勢；而桐油作為制造環(huán)保型油漆最適宜的原料，其需求量正日益增長；與之相對應，油桐產(chǎn)業(yè)的發(fā)展將極大地帶動我國貧困地區(qū)的經(jīng)濟發(fā)展，對于精準扶貧具有重要的戰(zhàn)略意義[2]。此外，桐油與柴油有著相似的物質(zhì)結構，是制造生物柴油的一種優(yōu)質(zhì)原料。油桐作為生物質(zhì)能源樹種有望成為緩解我國能源短缺問題的重要生物質(zhì)能源樹種之一[3]。因此，油桐產(chǎn)業(yè)發(fā)展的受重視程度日益增長，油桐的生物學研究也逐漸增多，并已取得了很多重要的進展。本文將總結油桐的組學研究、光合生理、油脂形成機理和組培快繁等方面的研究進展，討論目前研究中存在的問題，并對未來發(fā)展方向進行展望。

1 花的發(fā)育與性別決定

油桐為雌雄同株異花植物，較低的雌雄花比例是其產(chǎn)量較低的主要原因，探究其花性別決定的機制，對于培育高雌花比例的油桐品種至關重要。Mao 等[4]利用形態(tài)學與比較轉錄組方法研究了油桐性別決定的分子機制，他們發(fā)現(xiàn)油桐花發(fā)育可以分為12 個時期，在第7 個時期，雌花和雄花開始出現(xiàn)形態(tài)上的分化。雄花一直是單性的，而雌花則具有兩性特征，其雄蕊僅發(fā)育至造孢母細胞時期，之后便發(fā)生細胞死亡。雌花和雄花比較轉錄組結果表明，雌花的二態(tài)性受到茉莉酸、一些重要的轉錄因子以及與花分生組織活性相關基因的影響。后續(xù)的蛋白質(zhì)組研究[5]鑒定出2 個雄花中特異表達的蛋白和10 個雌花中特異表達的蛋白，后者包括抗壞血酸過氧化物酶、天冬氨酸蛋白酶、親環(huán)蛋白等，都與雄蕊的敗育和雌蕊群的形成有關系，作者認為他們可作為潛在的油桐花性別分化的分子標記。Liu 等[6]通過形態(tài)學和細胞學觀察、內(nèi)源激素測定和RNA-seq 等方法探討了油桐雌花發(fā)育的分子機制。形態(tài)學觀察表明，雌花雄蕊的凋謝屬于細胞程序化死亡（PCD），是在小孢子母細胞時期絨氈層退化的結果。通過RNA-seq 鑒定出279 個差異化表達基因，這些基因與苯丙烷生物合成、苯丙氨酸代謝、類黃酮合成、淀粉和蔗糖代謝以及植物激素信號轉導相關。基因表達分析證實17 個與花粉和花藥發(fā)育相關基因以及37 個PCD 相關基因都參與到這個過程中。對植物激素水平進行分析表明水楊酸的積累觸發(fā)了PCD，并且抑制了雌花雄蕊的發(fā)育。

2 光合作用和礦質(zhì)營養(yǎng)

光合作用是油桐種子油脂合成的基礎，決定了油桐的產(chǎn)量和品質(zhì)。石凱等[7]分析了4 種光照條件（100%、75%、50%和20%光強度）對油桐幼苗生長的影響，發(fā)現(xiàn)光照強度的降低將導致油桐的凈光合速率、氣孔導度、最大光化學效率、表現(xiàn)光合電子傳遞速率及蒸騰速率的降低。不同農(nóng)林作物的間作同樣會對光合作用產(chǎn)生影響，油桐幼林套種大豆的研究[8]表明，套種大豆降低了油桐幼苗的光飽和點、光補償點和CO2補償點，說明套種大豆雖然降低了油桐幼苗的光合能力，但有利于提高油桐幼苗對弱光的利用能力，且有助于光合產(chǎn)物的積累。

礦質(zhì)營養(yǎng)水平對植物的光合作用具有直接的影響，補充礦質(zhì)營養(yǎng)對于油桐生長發(fā)育具有重要作用。李澤等[9]利用營養(yǎng)液砂培試驗發(fā)現(xiàn)低鎂濃度（Mg2+＜2 mmol·L-1）顯著抑制了油桐的生長，葉綠素含量、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活性、凈光合速率、水分利用效率、最大光化學效率等參數(shù)顯著降低。這些指標會隨著鎂離子濃度的增高而增高；當鎂離子濃度為2 ～4 mmol·L-1時，最有利于油桐幼苗正常生長。與此類似，劉凱 等[10]也發(fā)現(xiàn)低鎂濃度顯著降低了2 種油桐葉片最大凈光合速率等光合參數(shù)，增加了游離脯氨酸的含量。此外，根外追肥能夠提高油桐幼苗的光合能力，從而增加了生物量的積累，如葉片噴施尿素和KH2PO4能夠顯著提高油桐幼苗葉片的凈光合速率等光合參數(shù)，葉面噴施尿素的作用比KH2PO4的作用更明顯[11]。在基因研究層面，Zhou 等[12]克隆得到了1 個油桐中編碼磷酸鹽轉運蛋白的基因（Pht1;1），并進行了結構預測與表達模式分析，發(fā)現(xiàn)該基因在成熟葉柄中表達量最高，種子中也有較高表達；故推測Pht1;1可能具有多種磷元素攝取和轉運功能。

3 生物與非生物脅迫

與常見農(nóng)作物相比，我國經(jīng)濟林往往種植在環(huán)境惡劣、缺少管理的地區(qū)，因此經(jīng)濟林時常面臨干旱低溫等問題。探究油桐對于干旱等逆境脅迫的反應，對于培育具有更強適應性的油桐品種具有重要意義。張帆航等[13]選取1年生油桐幼苗為試驗材料，研究了低溫（8 ℃）和高溫（38 ℃）對油桐幼苗生長及生理特性的影響。結果表明低溫和高溫均可導致油桐幼苗生長減緩，葉綠素含量下降，抗氧化酶（如過氧化物酶）活性升高，以及可溶性糖和丙二醛含量上升。葉片噴施油菜素內(nèi)酯可以減輕溫度脅迫對油桐葉片的抑制程度，增強油桐葉片的生理功能，如提高葉片內(nèi)各種抗氧化酶活性，降低丙二醛含量等，進而增加油桐幼苗的抗熱性和抗寒性。此外，長期低溫不僅顯著降低油桐樹幼苗的光合效率，還影響植物葉片內(nèi)部結構的形成，破壞了葉綠體的完整性和功能；而將油菜素內(nèi)酯外用在油桐樹幼苗上，可以通過維持葉片結構、形態(tài)、功能的穩(wěn)定，減輕凍害造成的傷害，從而提高桐樹的光合潛力[14]。干旱也是對油桐生長產(chǎn)生影響的因素之一，Li 等[15]研究發(fā)現(xiàn)干旱處理12 d（土壤含水量由27.3%降至9.5%）導致油桐幼苗相對葉綠素含量降低，1,5-二磷酸核酮糖羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性降低，光合速率和光系統(tǒng)II 的光化學效率降低；外源施用CaCl2能夠提高油桐幼苗的干旱耐受性，其中5 mmol·L-1比2 mmol·L-1和10 mmol·L-1的CaCl2更為有效。不同的水分供應量同樣會對油桐的生長產(chǎn)生影響[16]：輕度干旱脅迫（70%土壤最大持水量）對三年桐和千年桐幼苗的生長無明顯影響；中度干旱（50%土壤最大持水量）及重度干旱（35%土壤最大持水量）使2 種油桐的生長量、凈光合速率和最大光化學效率等指標顯著下降。不同之處在于：中度干旱脅迫下，油桐幼苗凈光合速率的降低是由氣孔因素及光合機構活性降低共同引起的；而重度干旱脅迫下，凈光合速率降低主要是由光合機構活性降低引起的。該研究還發(fā)現(xiàn)三年桐的光合機構活性及光合效率高于千年桐，對干旱脅迫的適應性要強過千年桐[16]。在基因研究上，劉美蘭等[17]克隆了油桐乙醛脫氫酶基因ALDH2B4和ALDH2B7，發(fā) 現(xiàn)ALDH2B4在 嫩葉的表達量最高，而ALDH2B7在花瓣的表達量最高，2 個基因表達都受高鹽、干旱和脫落酸調(diào)控，它們可能在油桐逆境脅迫應答和脫落酸信號途徑中發(fā)揮作用。

過量農(nóng)藥的使用同樣會造成脅迫，萬盼等[18-19]分析了2 種農(nóng)藥百草枯和氰戊·樂果對油桐幼苗葉綠素熒光特性及生長的影響。結果表明：高濃度百草枯（≥1/200）和氰戊·樂果（≥1/500）能夠顯著降低油桐幼苗葉綠素含量和光合速率，表現(xiàn)為油桐幼苗的光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學效率、光化學猝滅系數(shù)和電子傳遞速率均顯著低于對照，從而抑制油桐幼苗株高、地徑和單株生物量的生長，降低油桐幼苗根冠比，進而導致根系吸收面積減少，影響幼苗后期的生長。在商品規(guī)定施用濃度下，百草枯（1/400）和氰戊·樂果（1/1 000）的施用對油桐幼苗光合速率和生長影響均較小。

油桐容易受到尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumf.sp.Fordiis，F(xiàn)of-1）的毀滅性傷害，木油桐Vernicia montana則具有較強的抗性。Zhang 等[20]在Fof-1侵染油桐根部過程中的不同階段進行了對比轉錄組分析，分別在油桐和木油桐中發(fā)現(xiàn)了434 和192個差異性表達的轉錄因子；通過共表達分析發(fā)現(xiàn)含有B3 結構域的轉錄因子（VmB3-01），可能在油桐對Fof-1 的抗性中發(fā)揮著重要作用。

4 油桐基因組研究

Li 等[21]報道了油桐葉綠體基因組，其序列長度為161 528 bp，含有1 對反向重復序列（IRs），被1 個小的單拷貝（SSC）和1 個大的單拷貝（LSC）所分割開，包含114 個基因，編碼81 個蛋白質(zhì)、4 個rRNA 和29 個tRNA。與麻風樹葉綠體基因相比，油桐葉綠體基因組具有85 個單核苷酸多態(tài)性位點和82 個插入或缺失突變。Cui 等[22]對油桐進行了高質(zhì)量基因組測序，產(chǎn)生了176 Gb 基因組序列數(shù)據(jù)，組裝后的基因組大小為1 176 320 kb（scaffold N50 ＞474 kb），預測其包含47 000 個蛋白編碼基因。基因組和轉錄組分析顯示，油桐基因組包含與脂肪酸去飽和化和共軛化、酰基編輯以及甘油三酯的合成相關的基因。種子轉錄組分析揭示了脂肪酸合成基因特殊的表達模式，即脂肪酸β-氧化和甘油三酯合成在種子發(fā)育的中期協(xié)同發(fā)生，這2 個途徑在時間上的精確控制可能對于α-桐酸的積累至關重要。這些結果對于通過遺傳改良以提升油桐種子油脂含量具有重要作用。此外，Zhang 等[23]還報道了另外1 個染色體尺度的油桐基因組，其大小為1.12 Gb，包含28 422 個預測基因和超過73%的重復序列。同時基于基因組和RNA-seq 的數(shù)據(jù)，鑒定出了88 個核酸結合位點編碼抗性基因（nucleotide-binding site-encoding resistance genes），其中17 個基因有助于油桐在感染萎病菌后短期內(nèi)抗性的發(fā)揮。在該基因組中一共有651 個油脂相關基因被鑒定出來，其中88 個基因可能直接參與桐油的合成。另外該研究發(fā)現(xiàn)，油桐基因組中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因數(shù)量較少，并且一些轉錄因子與油脂合成的基因之間存在協(xié)同效應，這些都可能是種子種油脂含量較高的重要原因。值得注意的是，Zhang 等[23]還在油桐基因組測序的基礎上采用了不同生長階段的17個組織樣本建立了油桐全基因表達的eFP browser （http://bar.utoronto.ca/efp_tung_tree/cgi-bin/efpWeb.cgi），這項工作為油桐基因功能的深入研究提供了重要基礎。

5 分子標記與遺傳多樣性分析

分子標記對于現(xiàn)代植物育種具有重要的作用，而油桐為多年生喬木，其基因組龐大，一般采用轉錄組測序、種間擴增、全基因組關聯(lián)性分析等方法開發(fā)其分子標記。Zhang 等[24]對來自中國5個省的41 份油桐種子進行脂類分析，并通過轉錄組測序鑒定出818 058 個非重復序列基因，發(fā)現(xiàn)其中5 404 個具有SSR 標記位點，對其中98 個位點進行分析，開發(fā)了15 個多態(tài)基因SSR 標記，這些標記相關基因中的10 個基因能夠編碼功能蛋白，而且部分基因與種子油脂含量高度相關。該研究有助于了解油桐的遺傳多樣性和進行遺傳作圖。Zhang 等[25]曾在油桐基因組測序未完成之前，利用木薯基因組序列開發(fā)適用于油桐的SSR 標記，結果發(fā)現(xiàn)在木薯的225 個SSR 標記種的104 個適用于油桐。此外，ISSR 標記被用于分析2 個地理種群（恩施與遂寧）之間的遺傳變異和分化，結果表明這2 個地區(qū)的油桐種質(zhì)存在中等程度的遺傳多樣性，原因可能是空間上的隔離和歷史上長期的地方性繁育[26]。吳攀[27]對含油率不同的油桐樹的種子進行轉錄組測序分析，鑒定到分布于 15 340 個注釋基因上的70 315 個SNP 位點，并對含有SNP 位點的基因進行GO 分類和KEGG 富集分析，發(fā)現(xiàn)1 096 個SNP 位點匹配到與油脂合成相關的GO 分類的基因上，1 231 個SNP 位點位于脂肪酸合成相關KEGG 通路中，這些SNP 位點有望進一步開發(fā)為功能分子標記。除此之外，對于篩選到的21 個可能影響油桐種子含油率和脂肪酸組分的候選SNP 位點，通過候選基因位點與油桐種子含油率等表型性狀之間的關聯(lián)分析獲得5 個顯著關聯(lián)的位點，其中3 個分別在VfPDAT2、VfLPAAT1和VfPDH-α3的5’-UTR 區(qū)域，說明這些SNP 變異位點很可能在調(diào)控水平影響油脂積累[27]。

6 油脂合成的分子機制

桐油中含有80%左右的桐酸，桐酸是具有3 個共軛雙鍵特異脂肪酸，其化學性質(zhì)活潑，是優(yōu)質(zhì)、多用途的工業(yè)原料。長期以來，油桐中油脂合成途徑一直是關注的焦點，從20 世紀90年代至今，研究人員開展了大量的桐油合成機理研究，其中Shockey 等[28]鑒定出2 個甘油二脂酰基轉 移 酶（diacylglycerol acyltransferases，DGAT）DGAT1和DGAT2，通過酵母異源表達證明這2 個基因參與桐油的合成。此外，Dyer 等[29]發(fā)現(xiàn)2 個油酸去飽和酶FAD2 和FADX 在發(fā)育的種子中特異性地表達，酵母異源表達試驗結果表明，F(xiàn)AD2能夠將油酸轉化為亞油酸，而FADX 能夠將亞油酸轉化為桐酸。這些重要的研究都為揭示桐油合成機理奠定了重要的基礎。近年來，越來越多的組學研究技術也被應用到對于油桐油脂合成機制的研究當中，通過對油桐基因組的分析，Zhang 等[23]發(fā)現(xiàn)了幾個重要的參與油脂合成的新基因，其中包括2 個FAD3基因，其負責Δ15 亞油酸的去飽和，在種子發(fā)育的早期高度表達；除此之外，進化樹研究表明，F(xiàn)AD2和FADX基因被分在2 個分化枝上，這可能來源于雙子葉植物祖先的基因組加倍事件。Galli 等[30]通過對成熟油桐種子進行轉錄組測序，重點關注脂質(zhì)代謝途徑基因的表達，結果發(fā)現(xiàn)，基因BCCP，F(xiàn)AD2，F(xiàn)AD3，F(xiàn)ADX，F(xiàn)AD9，DGAT2和OleoI在種子發(fā)育后期高度表達，與油脂積累正向相關。同樣通過比較轉錄組方法，Zhang 等[31]采用RNA-seq 技術對高含油率油桐樹和低含油率油桐樹不同發(fā)育時期的種子進行轉錄組測序分析，結果表明，高含油率的原因在于與糖酵解、脂肪酸合成以及三酰甘油酯組裝相關基因在油料積累的后期仍高度表達；基因PII、LEC1和LEC1-LIKE應該對于高含油率的產(chǎn)生具有重要作用。除了轉錄組分析，蛋白質(zhì)組分析也被用于研究油桐油脂合成過程，Zhan 等[32]發(fā)現(xiàn)油桐種子油脂的積累胚乳細胞內(nèi)油體的體積和數(shù)量正相關，并開展了蛋白質(zhì)組分析，鑒定出了76 個蛋白，這些蛋白多數(shù)與能量代謝、脂肪酸代謝以及對抗病菌有關。此外，Chen 等[33]鑒定并比較了油桐和大戟科其他物種的tRNAs，86 個差異表達的tRNAderived RNA 片段（tRFs）被鑒定出來與脂類合成有關，其中11 個已被研究證明受到17 個tRFs 的調(diào)控。這些都有助于認識油脂合成的遺傳機制。

除去組學研究之外，對油桐特定基因的研究工作也取得了一定的進展。油桐油脂積累在油體中被低分子親水的油體蛋白（OLE）所包裹，Cao等[34]對22 個樹種（如桐樹、茶樹、蓖麻等）的OLE 進行分類并開展全基因組分析，鑒定保守序列基序和氨基酸殘基、預測OLE 的二維和三維結構。李捷宇等[35]克隆了油桐長鏈脂酰輔酶A 合成酶基因（Long-chain acyl coenzyme A synthetase，LACS）家族的2 個成員LACS4和LACS8基因，并檢測了不同組織部位和種子不同發(fā)育時期各基因的表達水平，其中LACS8基因在發(fā)育種子中的表達模式與之相一致，推測該基因可能與種子發(fā)育過程中的油脂積累相關。Long 等[36]克隆了β-酮脂酰-ACP 合成酶基因（β-ketoacyl-acp synthase gene，KAS），并進行了表達模式與組織特異性分析；結果顯示油桐樹中有不同的時空表達模式，與成熟組織相比，KAS-Ⅱ在幼嫩組織中的表達水平明顯降低，而在幼莖和幼葉中，KAS-Ⅲ的表達水平最高。劉美蘭等[37]克隆了FATB1基因，并對該基因的表達模式和表達部位進行了研究分析，結果顯示FATB1是1 個位于葉綠體中且含有多個催化功能結構的蛋白，表達模式與油脂積累相同，因此它可能與油脂合成有著密切的關系。楊丹等[38]研究了桐酸合成酶基因FADX在油桐種子發(fā)育過程中的表達特征，結果顯示FADX在油桐果實發(fā)育早期處于低表達狀態(tài)，從果實發(fā)育中期開始大量表達，這與油桐桐酸含量在果實發(fā)育過程中的變化規(guī)律一致。Yang 等[39]克隆到7 個油桐NF-YB家族轉錄因子基因，發(fā)現(xiàn)NF-YB1、5和11主要在種仁中表達，推測其有可能參與到種子發(fā)育或脂肪酸合成。

7 組織培養(yǎng)

目前油桐繁殖方法是通過有性生殖獲得種子、再播種育苗，實生后代植株參差不齊，植株間產(chǎn)量品質(zhì)差異極大，從而顯著影響到油桐品種產(chǎn)量潛力的發(fā)揮與桐油品質(zhì)的穩(wěn)定性。優(yōu)異基因型的優(yōu)良性狀不能通過有性繁殖穩(wěn)定地傳遞給后代，克服此問題的有效途徑就是無性繁殖。植物組織培養(yǎng)作為一種高效的無性繁殖方式，相關技術在油桐中同樣得到重視。早在2009年，張姍姍等[40]就通過無菌苗莖段誘導產(chǎn)生不定芽，進而生根的方式建立了油桐的組培快繁體系。之后，李澤等[41]以“葡萄桐”種胚為試材建立了油桐種胚成苗的組培體系。譚曉風等[42]以油桐無菌苗葉片為外植體，篩選獲得了愈傷組織誘導、不定芽分化、增殖及后續(xù)生根的最適宜培養(yǎng)基。近年來，林青等[43]以油桐無菌苗葉柄為外植體直接誘導不定芽實現(xiàn)植株再生；而穆燕等[44]以油桐無菌苗下胚軸為外植體，通過直接器官發(fā)生（誘導不定芽）途徑建立了簡單的、可重復的油桐離體再生體系。谷戰(zhàn)英等[45]以油桐成熟葉片和組培苗幼葉為材料，通過酶解法成功分離得到油桐葉肉細胞的原生質(zhì)體，并以獲得的原生質(zhì)體為受體系統(tǒng)，建立了PEG 介導的油桐原生質(zhì)體基因轉化方法，對于通過細胞融合和基因工程手段進行油桐種質(zhì)創(chuàng)新具有重要的意義。

8 總結與展望

油桐在我國有上千年的栽培歷史，我國的桐油生產(chǎn)曾經(jīng)在世界上具有重要影響力。面對新的發(fā)展機遇（環(huán)保型材料和生物質(zhì)能源的開發(fā)等），重新挖掘和利用油桐資源，發(fā)揮其在材料工業(yè)、國防工業(yè)、生物質(zhì)能源等領域的重要作用，推進油桐產(chǎn)業(yè)的快速和規(guī)模化發(fā)展，是當前油桐相關科技工作者的重大而艱巨的任務[1]。近5年來油桐相關的生物學研究得到了全面的開展，并取得了一系列的重要成果，主要包括油桐基因組測序的完成、油桐花發(fā)育和性別決定的研究、相關植物組織培養(yǎng)技術的建立以及油桐特殊油脂產(chǎn)物——桐油合成的關鍵基因發(fā)掘等。但目前的研究仍然存在一些尚未解決的重要問題，具體如下：

1）雖然油桐基因組測序已完成，但對于其深入挖掘和利用的工作有待進一步進行。例如開展比較基因組學的研究和開展基于桐油合成的全基因組關聯(lián)研究等。

2）目前一批與油桐響應環(huán)境變化、參與特殊油脂合成的基因已被初步發(fā)掘，但對于這些基因功能的認識都缺乏有力的遺傳學證據(jù)。其主要原因在于缺少相應的轉基因和基因編輯研究，因此未來應該注重轉基因及基因編輯相關的研究。

3）目前我國油桐林多數(shù)處于山區(qū)地帶，時常面臨干旱、營養(yǎng)缺乏和光照不足等逆境，開展油桐響應與適應逆境以及養(yǎng)分吸收利用等方面的研究是進行油桐品種改良的重要前提。而目前多數(shù)研究所采用的材料為溫室環(huán)境下的盆栽幼苗，這并不能完全反映成年樹木在真實生產(chǎn)環(huán)境中的情況，更不能反映實地環(huán)境對于桐油產(chǎn)量和品質(zhì)的影響。因此應該加強實地成年油桐的研究，以更好地為生產(chǎn)和育種提供理論基礎。

4）目前油桐林栽植中的種苗來源主要是種子播種，但油桐實生后代植株參差不齊，植株間產(chǎn)量品質(zhì)差異極大，油桐品種產(chǎn)量與桐油品質(zhì)都受到顯著影響。在目前油桐組培快繁技術較為成熟的情況下，應加速油桐的組培快繁技術的推廣應用，以解決油桐單株產(chǎn)量和桐油品質(zhì)不穩(wěn)定的問題。