不同構型吉法酯對干眼癥大鼠角膜的保護作用*

糜玲， 周波， 李永， 彭金剛， 湯磊， 黃家宇

(1.貴州醫科大學 藥學院 藥物分析教研室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州省化學合成藥物研發利用工程技術研究中心， 貴州 貴陽 550004)

干眼癥又稱干燥性角膜結膜炎，是多種因素所致的一種淚液和眼表疾病，包括眼表不適癥狀、視力變化和淚膜不穩定，并且伴有潛在的眼表損害，是眼科中發病率最高的眼表疾病之一[1-2]。目前干眼癥的治療多為人工淚液替代療法，臨床常用的人工淚液大多僅補充水液層，個別制劑中添加了脂質成分以降低淚液蒸發，改善黏蛋白功能的人工淚液國內尚無上市產品，目前國外進入臨床研究的主要是P2Y2受體激動劑(如地夸磷索四鈉滴眼液)和黏蛋白分泌激動劑(包括瑞巴派特和吉法酯)2大類[3-4]。吉法酯，商品名惠加強-G，是一種黏蛋白分泌激動劑，臨床上用于胃黏膜保護劑，還可以在干眼癥中發揮治療作用[5-7]。市售吉法酯為4Z構型吉法酯和4E構型吉法酯2種異構體的混合物[8]，但是哪一個構型的吉法酯在干眼癥的治療作用中起主要作用尚不明確。因此，本研究通過建立干眼癥大鼠動物模型，使用Shirmer I方法測量大鼠淚液分泌體積、角膜熒光素鈉染色評價角膜光滑度、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色法觀察角膜形態學及過碘酸雪夫氏(periodic acid-Schiff, PAS)染色法計數結膜杯狀細胞數量，探討4Z、4E吉法酯及混合型吉法酯對干眼癥大鼠角膜的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物及分組 6周齡的雌性Wistar大鼠40只，體質量160～180 g，購自重慶騰鑫生物技術有限公司。在各12 h明暗周期、溫度22 ℃、濕度40%～50%的飼養室飼養1周適應后，隨機分為正常組、生理鹽水對照組、4Z吉法酯治療組(4Z組)、4E吉法酯治療組(4E組)和混合吉法酯治療組(混合組，4Z ∶4E=30 ∶70)，每組8只。

1.1.2藥物和試劑 4Z構型和4E構型吉法酯由貴州醫科大學藥物化學重點實驗室湯磊教授課題組制備(純度大于98%)，東莨菪堿氫溴酸鹽購自上海泰坦科技股份有限公司(批號P1231580)，熒光素鈉購自美國Sigma公司(批號46960-100G-F)，淚液檢查酚紅棉線購自天津晶明新技術開發有限公司(批號20161201)，HE染色試劑盒(批號G1120)和PAS糖原染色試劑盒(批號G1281)購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3儀器 SLM-2ER型眼科裂隙燈顯微鏡檢查儀購自重慶康華瑞明科技股份有限公司，NIKON TS100型倒置相差顯微鏡購自日本Nikon公司，RM2235型石蠟切片機購自德國Leica公司。

1.2 實驗方法

1.2.1干眼癥動物模型 除正常組外，其余各組大鼠皮下注射6 g/L東莨菪堿氫溴酸鹽，4次/d(9時、12時、15時和18時)、0.5 mL/次，連續給藥28 d[9-10]；期間用風扇增強室內空氣對流，除濕機控制空氣相對濕度為30%～40%[11]。

1.2.2給藥方案 各治療組大鼠分別使用10 g/L相應構型吉法酯滴眼液治療 ，5次/d(9時、11時、13時、15時及17時)、每只眼睛20 μL/次，連續治療14 d；正常組和生理鹽水組大鼠用同體積的生理鹽水于相同時間點滴眼。

1.2.3Shirmer I試驗 于治療前、治療第7及14天腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，待角膜反射消失后，將酚紅棉線在距離外側角約1/3處的下穹窿中放置30 s后拔出，記錄棉線紅色部分長度(mm)來代表大鼠淚液體積的分泌量[12]。

1.2.4角膜熒光素鈉染色評分 每次Shirmer I試驗結束后，每只眼睛滴入0.01%熒光素鈉5 μL，3次人工眨眼后在裂隙燈下用鈷藍光觀察熒光素鈉著色情況并拍照。將眼表分為4個象限，每個象限根據染色情況評分，具體評分標準是無染色為0分，分散、點狀染色為1分，成群點狀染色為2分，成片狀染色為3分；4個象限評分總和為該鼠的角膜染色評分[13-14]。

1.2.5HE染色 治療第14天時，麻醉后冰上處死大鼠，立即摘除左右眼球，置固定液保存于4 ℃；常規石蠟脫水，進半苯半蠟前沿角鞏膜緣剪開眼球并去除玻璃體，常規石蠟包埋，平行于眼軸作6 μm連續切片，烤片后石蠟切片脫蠟至水，放入蘇木精染料10 min后蒸餾水清洗3次，伊紅染料5 min后常規脫水封片，顯微鏡下觀察角膜組織形態并拍照。

1.2.6PAS染色 石蠟切片常規脫蠟后蒸餾水浸泡10 min，按照PAS糖原染色試劑盒說明書步驟對切片進行染色后，梯度酒精脫水，二甲苯透明后樹膠封片，每個切片在顯微鏡下取3個視野計數杯狀細胞、取平均，并拍照。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 淚液體積

治療前，各治療組大鼠與生理鹽水組之間淚液體積比較差異均無統計學意義(P>0.05)；治療第7天時，4E組和混合組大鼠的淚液體積大于生理鹽水和4Z組大鼠，差異均有統計學意義(P<0.01或P<0.05)；治療第14天時，各組大鼠的淚液體積均略有所升高，各治療組淚液體積明顯高于生理鹽水組大鼠(P<0.01)，但同期各治療組大鼠之間差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：與同期生理鹽水組比較，(1)P<0.01,(2)P<0.05；(3)與同期4Z組比較，P<0.01。圖1 各組大鼠淚液體積的比較Fig.1 Tear volume of rats in each group after treatment

2.2 角膜熒光素鈉染色評分

治療前，各治療組大鼠與生理鹽水組之間角膜熒光素納染色評分比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；治療第7天時，4E組大鼠角膜熒光素納染色評分低于與生理鹽水組(P<0.05)，其余治療組與生理鹽水組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；治療第14天，各治療組大鼠角膜熒光素納染色評分明顯低于生理鹽水組(P<0.01)，但各治療組之間差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

注：與生理鹽水組相比，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖2 各組大鼠角膜熒光素鈉染色評分Fig.2 Difference of corneal fluorescein sodium staining score in each group of rats

2.3 HE染色

與正常組大鼠比較，生理鹽水組大鼠角膜上皮細胞略有增厚，各層細胞分層不明顯，細胞體積變大、排列不緊密、核間距較大，部分基底層細胞缺失出現空泡，且上表層細胞有脫落現象，越靠近角膜表面細胞逐漸變成鱗狀上皮細胞；與生理鹽水組大鼠相比，各治療組大鼠角膜的病理變化有一定程度減輕，即細胞排列變得緊密，核間距減小，鱗狀上皮細胞減少；4Z組大鼠的角膜表皮上層細胞變得光滑，基底層細胞還有部分空泡出現；4E組和混合組上層細胞細胞排列最為規則，且基底層排列緊密無空隙。見圖3。

注：A為正常組，B為生理鹽水組，C為4Z組，D為4E組，E為混合組。圖3 治療第14天時各組大鼠角膜形態學改變(HE，×200)Fig.3 Difference of HE staining in cornea of rats in each group(HE，×200)

2.4 PAS染色及杯狀細胞計數

PAS梁色結果顯示，杯狀細胞分布于結膜的上皮細胞層，染色后呈玫紅色(箭頭所指出)，可分泌黏蛋白潤濕角膜和結膜、保護眼表，與正常組大鼠相比，生理鹽水組大鼠結膜杯狀細胞明顯減少(見圖4)。杯狀細胞計數結果顯示，各治療組大鼠結膜杯狀細胞數量分別高于生理鹽水組大鼠，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；4E組和混合組大鼠杯狀細胞數量均高于4Z組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

注：A為正常組，B為生理鹽水組，C為4Z組，D為4E組，E為混合組；箭頭所示為杯狀細胞。圖4 治療第14天時各組大鼠PAS染色(200×)Fig.4 The difference of PAS staining among different groups of rats(200×)

注：與生理鹽水組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01；(3)與4Z組比較，P<0.05。圖5 治療第14天時各組大鼠杯狀細胞計數Fig.5 Goblet cell counts in each group of rats

3 討論

干眼癥是一種眼表自身免疫性疾病，目前尚無特效治療藥物，影響超過35%的人群，其核心病變是因淚液長期質或量的改變引起淚膜不穩定而導致的眼表損傷[12]。淚膜是位于角膜前端的一層淚液薄膜，由具有潤濕和清潔眼表作用的淚液組成，正常人眨眼時淚液就會均勻分布于眼表形成淚膜，任何原因引起淚膜的不穩定均會引起眼表疾病[13]。干眼癥患者由于長時間的淚液缺失會引起眼表一系列的變化，角膜熒光素鈉染色能直觀反映眼表損傷情況，HE染色可以觀察角膜上皮細胞的形態學改變。本次研究結果顯示，與正常組大鼠相比，造模組大鼠由于藥物和環境的影響，從第7天開始淚液明顯減少，持續干擾第14天時能觀察到角膜熒光素鈉染色評分明顯升高，同時通過HE染色可觀察到角膜上皮細胞鱗狀化生，嚴重時可見上皮細胞脫落。眼表給予不同構型吉法酯治療后，角膜熒光素鈉染色和HE染色結果都顯示吉法酯能明顯改善干眼癥大鼠的眼表損傷情況，且4E吉法酯優于4Z吉法酯。這與淚液體積的結果相互印證，各構型吉法酯對干眼癥大鼠都有保護作用，且4E構型吉法酯治療后第7天療效明顯，4Z構型吉法酯治療第14天時才能發揮比較好的治療效果。

黏蛋白是一類大分子糖化蛋白分泌細胞，主要是參加角膜上皮細胞防御機制，固定淚膜水液層，防止淚液水分流失，使其形成凝膠，從而達到穩定淚膜的作用[14]。已有研究顯示干眼癥患者通常伴隨著結膜杯狀細胞內部總量和分布的變化，其缺失可以導致黏蛋白分泌減少，引起淚膜不穩定[15]；眼表上皮細胞分泌產生膜結合型黏蛋白，與分泌性黏蛋白形成保護、潤滑眼表的親水性屏障，有助于淚液的穩定性以及保持淚膜的親水性[16-17]。黏蛋白主要就是由結膜杯狀細胞分泌，PAS染色結果顯示，2種吉法酯在治療第14天后都能增加干眼癥大鼠的結膜杯狀細胞數量(P<0.05)，且4E治療組的杯狀細胞數量多于4Z治療組及混合治療組(P<0.05)，與4Z吉法酯和混合吉法酯相比，4E構型吉法酯能更好地增強干眼癥大鼠淚膜穩定性。這種構型差異帶來的藥效差異可能是因為藥物分子的雙鍵或剛性或半剛性結構導致分子內自由旋轉受到限制而產生的，藥物結構中的某些官能團在空間排列上出現差異，幾何異構體空間結構上的差異均可影響藥物分子的理化性質，導致藥物分子在生物體中吸收、分布和代謝產生差異、最終導致藥理藥效的不同 。

綜上所述，4Z、4E及混合式吉法酯都能對干眼癥大鼠在增加淚液體積、降低眼表損傷和增加結膜杯狀細胞數量等方面有不同程度的保護，且4E構型吉法酯在增加淚液體積和減少角膜熒光素鈉染色評分方面明顯優于4Z構型吉法酯，對吉法酯的使用具有指導意義。