RANKL基因rs9594738位點與貴州燃煤污染型地氟病的相關性*

田薇， 李鳴， 喻艷琴， 張秀秀， 王嬋娟， 張婷， 單可人，官志忠， 何燕*

(1.貴州醫科大學 地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 貴州省醫學分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

燃煤污染型地方性氟中毒(簡稱燃煤污染型地氟病)是由于氟污染地區居民使用高氟煤而污染環境介質或食物，從而引起以氟斑牙和(或)氟骨癥為主要特征的一種慢性全身性疾病[1-2]。氟骨癥是地氟病最嚴重的臨床癥狀之一，主要表現為骨硬化、骨軟化及骨質疏松等癥狀[3-4]。有研究表明，氟骨癥的發病機制與骨的形成有極大的關系[5]，而核因子κB受體活化因子配體(receptor activatiw of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)具有調節骨代謝的作用，其在巨噬細胞克隆刺激因子(macrophage-colony stimulating factor，M-CSF)存在的前提下與破骨細胞膜上特異性受體RANK結合，啟動對破骨細胞的分化、成熟、活化的調節過程，抑制破骨細胞的凋亡，從而加速并增強骨吸收的過程[6-8]。多年來，陸續有研究報道了RANKL基因多態性與骨的形成相關疾病有關[9-10]，如王希丹等[11]研究發現RANKL基因的 rs9594738位點與髖部骨強度相關，Hsu 等[12]研究發現RANKL基因的 rs9594738位點與骨質疏松有相關性，但目前RANKL基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)與地氟病關系的研究尚未見報道。本研究旨在通過分析RANKL基因rs9594738位點在貴州燃煤污染型地氟病病區地氟病患者及對照縣人群中的多態性分布，探討該位點的多態性與燃煤污染型地氟病的關聯性，為燃煤污染型地氟病的發病機制、預防和治療提供一定的依據和線索。

1 對象與方法

1.1 對象

參照《地方性氟中毒病區劃分標準》(GB17018-1997) 劃分貴州省地氟病病區。在知情同意原則下，按照簡單隨機抽樣原則，在貴州省畢節市典型燃煤污染型地方性氟中毒病區采樣(統稱為疾病組)。疾病組根據地氟病的嚴重程度分為地氟重癥組(地氟病病區有氟骨癥且氟斑牙明顯患者)130例，男35例、女95例，平均年齡(59.49±11.61)歲；地氟輕癥組(地氟病病區僅有氟斑牙患者)235例，男80例、女155例，平均年齡(52.38±14.48)歲。以黔南布依族苗族自治州長順縣的樣本 235例為對照組(無氟污染地區無地氟病癥狀人群)，男94例、女141例，平均年齡(48.75±16.97)歲。

1.2 方法

1.2.1模板標化 從實驗室-80 ℃冰箱中取出樣本全血基因組DNA，使用Thermo ScientificTMNanoDrop Lite對全血基因組DNA定量后，標化至3 mg/L。

1.2.2基因分型 采用TaqMan-MGB 實時熒光定量PCR法對RANKL基因rs9594738位點進行基因分型。PCR反應總體系為10 μL，其中3 mg/L DNA溶液1.0 μL，TaqMan genotyping Master MixⅡ 3 μL，rs9594738探針 0.15 μL，加無菌ddH2O補足至10 μL；PCR反應條件為60 ℃ 30 s，95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，循環40次， 60 ℃ 30 s結束反應。采用Step One Software v2.3軟件對擴增結果進行分析。完成檢測后各種基因型隨機抽取5%的樣本進行測序驗證，測序結果與分型結果100%相符。

1.2.3測序驗證 從分型結果中將不同基因型隨機各抽取5%樣本送生工生物工程(上海)股份有限公司測序驗證。測序引物為上游5′- GCCTGTGGCTTGTGGGTAT-3′,下游 5′-TCTCTGATGTTTGTGGGGGA-3′。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行統計分析，采用χ2檢驗檢測研究對象rs9594738位點的基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡以及SNP的等位基因、基因型頻率在各組間的分布差異、性別分布差異；利用SNPStats在線軟件對RANKL基因rs9594738位點進行遺傳模式分析，包括共顯性遺傳模式(Codominant model)、顯性遺傳模式(Dominant model)、隱性遺傳模式(Recessive model)、超顯性遺傳模式(Overdominant model)和加性遺傳模式模(Log-Additive model)，并根據赤池信息量準則(akaike information criterion,AIC) 和貝葉斯信息準則(bayesian information criterions,BIC) 數值的大小來確定SNP位點的最優遺傳模式，即AIC和BIC數值同時取最小值時的遺傳模式。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RANKL基因分型

人基因組RANKLrs9594738位點的熒光定量PCR擴增曲線結果顯示，RANKL基因rs9594738位點均有CC、CT及TT基因型，見圖1；采用Step One Software v2.3軟件對Real-time PCR擴增分析，結果顯示RANKL基因rs9594738位點在地氟病人群和對照組人群中均存在C和T等位基因以及CC、CT、TT 3種基因型，見圖2。

注：紅線為CC野生純合型，綠線為CT雜合型，藍線為TT突變純合型。圖1 RANKL基因rs9594738位點TaqMan-MGB探針介導的實時熒光定量PCR擴增曲線Fig.1 RANKL rs9594738 TaqMan-MGB probe mediated real-time fluorescence quantitative PCR amplification curve

注：紅點為CC野生型，綠點為CT雜合型，藍點為TT突變純合型，“X”為未確定。圖2 RANKL基因 rs9594738位點基因分型Fig.2 RANKL gene rs9594738 locus genotypic results

2.2 測序驗證

按照基因分型結果，隨機從RANKL基因rs9594738位點各基因型樣本中選取5%的樣本進行測序驗證(不足5例的基因型全部樣本測序)，測序結果與TaqMan-MGB探針介導的實時熒光定量PCR基因分型的結果完全符合。見圖3。

注：箭頭所示A為TC雜合型，B為CC野生型，C為TT突變純合型；紅色為堿基T，綠色為堿基A，藍色為堿基C，黑色為堿基G。圖3 RANKL基因 rs9594738位點測序Fig.3 Sequencing of RANKL gene rs9594738 locus

2.3 RANKL基因 rs9594738位點的基因型頻率和等位基因頻率分布

各組人群RANKL基因 rs9594738位點的基因型頻率和等位基因頻率分布情況顯示，地氟重癥組、地氟輕癥組人群分別與對照組人群的基因型頻率分布構成比較差異無統計學意義(P>0.05)，地氟輕癥組人群與對照組人群的等位基因頻率分布比較差異無統計學意義(P>0.05)，但地氟重癥組人群與對照組人群的等位基因頻率分布比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組人群RANKL基因rs9594738 位點基因型分布頻率和等位基因頻率分布Tab.1 Genotype and allele frequency distribution of RANKL rs9594738 locus in each group

注：(1)與對照組比較的χ2值。

2.4 RANKL基因 rs9594738位點基因型頻率及等位基因頻率分布的性別差異

基因頻率及等位基因頻率結果顯示，各組人群RANKL基因 rs9594738位點基因型分布頻率和等位基因頻率分布的性別差異結果顯示，地氟輕癥組和對照組的基因型頻率分布構成和等位基因頻率的性別比較，差異無統計學差異(P>0.05)；但地氟重癥組和對照組男女之間基因型頻率分布構成和等位基因頻率的性別比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組人群RANKL基因 rs9594738位點多態性分布的性別差異Tab.2 Gender differences in the polymorphism distribution of RANKL rs9594738 in each group

2.5 疾病組人群RANKL基因rs9594738位點的遺傳模式

利用SNPStats在線軟件對疾病組和對照組的RANKL基因rs9594738位點的等位基因進行遺傳模式分析，結果顯示RANKL基因rs9594738位點的最優遺傳模式是超顯性遺傳模式，在該模式下C/T基因型與地氟病的發病風險無關(P>0.05)。見表3。

表3 疾病組和對照組人群RANKL基因rs9594738位點的遺傳模式Tab.3 Allele and genotype distribution of RANKL rs9594738 in disease group and control group

2.6 地氟重癥組人群RANKL基因 rs9594738位點的遺傳模式

利用SNPStats在線軟件對地氟重癥組和對照組的RANKL基因rs9594738位點的等位基因進行遺傳模式分析，結果顯示RANKL基因 rs9594738位點的最優遺傳模式是顯性遺傳模式，在該模式下C/T和T/T基因型增加了地氟病的發病風險(P<0.05)。見表4。

表4 地氟重癥組人群和對照組人群RANKL基因 rs9594738位點的遺傳模式Tab.4 Genetic pattern analysis of RANKL rs9594738 in severe fluorine group and control group

2.7 地氟輕癥組人群RANKL基因 rs9594738位點的遺傳模式

利用SNPStats在線軟件對地氟輕癥組和對照組的RANKL基因rs9594738位點的等位基因進行遺傳模式分析，結果顯示RANKL基因 rs9594738位點的最優遺傳模式是隱性遺傳模式，在該模式下T/T基因型與地氟病的發病風險無關(P>0.05)。見表5。

表5 地氟輕癥組人群RANKL基因 rs9 594738位點的遺傳模式分析 Tab.5 Genetic pattern analysis of RANKL gene rs9594738 in mild fluorine group

3 討論

地氟病是一種嚴重危害身體健康的全身性疾病，分為飲水、飲茶和燃煤型氟中毒，臨床主要表征為氟斑牙和氟骨癥[13-14]。貴州是全國最嚴重的燃煤污染型地方性氟中毒病區[15]，官志忠等[16]研究發現貴州省燃煤型地氟病區主要分在貴州省的西部、西北部和北部，包括畢節市、六盤水市各縣區。其中爐灶使用及其燃煤方式是貴州省燃煤污染型地氟病流行的主要因素，由于農村居民長期使用無排煙設施的爐灶，燃煤過程排放的含氟煙塵嚴重污染室內空氣和食物，使生活在這一環境的人群因過量攝氟而引起慢性蓄積性氟中毒[17-18]。RANKL基因位于染色體13q14，RANKL蛋白包括317個氨基酸殘基，成骨細胞、骨髓基質細胞和成纖維細胞等是其主要來源[19]。RANKL是破骨細胞增殖、分化和存活的關鍵[20]。有研究報道RANKL基因rs2277438位點多態性可能在骨重建過程中起著重要的作用[21]；Wang等[22]研究發現RANKL基因rs784870位點的CC型基因與OPG基因rs2073618位點的CC型基因是漢族乳腺癌患者使用芳香化酶抑制劑，導致骨密度降低的風險基因型；亦有研究表明RANKL基因的rs9594738位點的單核苷多態性與骨質疏松等骨骼疾病有關[23]。地氟病的主要癥狀之一是氟骨癥，主要表現為骨硬化、骨軟化及骨質疏松等癥狀，是在特定地理環境中過量氟暴露而引起的全身慢性蓄積性氟中毒[24-25]。已有研究表明RANKL基因的表達強度與氟骨之間存在正相關關系[26]，但目前對于RANKL基因在地氟病中的多態性研究報道較少。本研究結果顯示地氟重癥組人群等位基因頻率分布與對照組人群相比差異有統計學意義(P<0.05)，從地氟重癥組人群等位基因頻率與對照組人群相比的結果來看，RANKL基因rs9594738位點多態性可能與氟骨癥的發病有相關性，這與RANKL基因的表達和Ⅱ型骨質疏松具有相關性一致[27]。

地氟重癥組和地氟輕癥組人群RANKL基因rs9594738位點多態性分布的性別差異比較結果顯示，地氟輕癥組和對照組的基因型頻率分布構成和等位基因頻率的性別差異均無統計學意義(P>0.05)，但地氟重癥組男女之間基因型頻率分布構成和等位基因頻率的性別差異均有統計學意義(P<0.05)。這一結果提示RANKL基因rs9594738位點在地氟重癥組人群中男女之間的分布可能存在差異。對疾病組和對照組進行遺傳模式分析，結果顯示在最優遺傳模式超顯性遺傳模式下，RANKL基因rs9594738位點的C/T基因型與地氟病的發生無關(P>0.05)，對地氟重癥組和對照組進行遺傳模式分析，結果顯示在最優遺傳模式顯性遺模式下，RANKL基因rs9594738位點C/T基因型與T/T基因型可能與氟骨癥的發生有關(P<0.05)。對地氟輕癥組與對照組進行遺傳模式分析，結果顯示在最優遺傳模式隱性遺傳模式下T/T基因型與地氟病的發生無關(P>0.05)。

綜上所述，本研究顯示RANKL基因rs9594738位點多態性與貴州省畢節市地氟病區患氟骨癥的可能有關，且其發病情況在男女之間可能存在差異；但是由于本研究樣本量相對較少，容易產生統計偏差，因此還需要大樣本量的研究進一步證實上述結果，從而進一步闡述RANKL基因rs9594738位點與地氟病的相關性。