NDRG2和AKT2與其磷酸化蛋白在肝癌病理組織中的應用及與臨床病理的相關性研究

陳 婷

(福建醫科大學附屬泉州市第一醫院病理科，福建 泉州 362000)

臨床研究表明：N-myc下調基因2(NDRG2)屬于是一種抑癌候選基因，其表達水平與腫瘤的發生、發展存在緊密的聯系[1]。而絲/蘇氨酸蛋白激酶2(AKT2)及其磷酸化蛋白(p-AKT2)在多數惡性腫瘤中均呈高表達，但是在肝癌中的應用研究較少[2]。因此，本文采用隨機病例選取方法進行研究，探討NDRG2和AKT2及p-AKT2在肝癌病理組織中的應用及與臨床病理的相關性，現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：選擇2016年4月～2018年3月治療的肝癌患者62例作為對象，男40例，女22例，年齡32～68歲，平均(45.81±5.77)歲；病例類型：肝細胞癌33例，肝管細胞性肝癌24例，混合型肝癌5例。Edmondson分級：Ⅰ級26例，Ⅱ級20例，Ⅲ級16例，Ⅳ級2例。納入標準：①入組患者均符合肝癌臨床診斷標準；②均行手術治療，術中取病灶標本；③能遵循醫囑完成相關治療、檢查。排除標準：①合并其他惡性腫瘤、精神異?；蛐g前給予放化療、免疫治療者；③合并精神異常、妊娠期或哺乳期者。

1.2方法

1.2.1NDRG2、AKT2 mRNA水平：①采用熒光定量PCR技術測定標本NDRG2、AKT2 mRNA水平：分別取病灶組織、癌旁組織，經PBS進行沖洗后加入500 μl trizol吹打，使得組織充分溶解，加入500 μl trizol充分混合、均勻。將上述溶液放入體溫5 min下使得蛋白體充分解體，加入0.2 ml氯仿，劇烈震蕩15 s，常溫下放置2～3 min，15 min離心，速度12 000 rpm，獲得三層液體(上層為水相、中間層與下層為有機相)。取RNA沉淀，轉移到新的EP管中，加入0.5 ml異丙醇，充分混合后放置在-20℃冰箱中，10 min離心，速度為12 000 rpm，可見凝膠狀沉淀(即為RNA)。充分洗滌RNA，并加入250 μl DEPC與750 μl乙醇，利用乙醇完成沉淀的沖洗，5 min離心，速度為7 400 r/min，取沉淀放入工作臺上進行20 min干燥。利用紫外分光度儀檢測RNA濃度并完成RNA提純(以Rnase作為空白對照)，在A260下測定吸光度值。采用Dnase酶處理RNA，處理完畢后放入冰箱中，備用。②PCR反應：檢測NDRG2、AKT2 mRNA表達量，根據胃癌病灶組織設置相關引物，設定反應條件：30℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min，連續進行35個循環，最后72℃下完成10 min延長。選擇獲得的擴增產物，放入1.5%瓊脂凝膠進行電泳，完畢后采用UVP凝膠圖像完成灰度值的測定，β-actin為內對照[3-4]。

1.2.2NDRG2、AKT2及p-AKT2水平：采用Western Blot法測定標本NDRG2、AKT2及p-AKT2水平。分別制作濃度為6%的積層膠和12%分離膠，每個組織蛋白濃度結果各上樣50 μg，轉膜2.5 h，電壓100 V，完成組織麗春紅染色，5%脫脂奶粉下進行1 h封閉，加入一抗，放置在塑料袋中進行15 h孵育，溫度4℃，復溫到室溫，緩慢搖晃1 h，加入三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液5 min，洗膜4次后加入二抗，搖床上振蕩，常溫下1 h孵育，PBS下5 min沖洗，連續進行4次洗膜。在暗室中利用ELC發光底物硝酸纖維素進行5 min顯影，X光底片下進行20 s壓片，25 s顯影，3 min定影，清水沖洗后晾干，最后利用數碼相機對結果進行拍照[5]。

1.3統計分析:采用SPSS18.0軟件處理，計數資料行χ2檢驗，采用率(%)表示，計量資料行t檢驗，采用均數±標準差表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1不同組織NDRG2、AKT2 mRNA水平比較:肝癌病灶組織與癌旁組織AKT2 mRNA水平差異無統計學意義(P>0.05)；肝癌病灶組織中NDRG2 mRNA水平，低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1不同組織NDRG2、AKT2 mRNA水平比較

組織類型例數NDRG2 mRNAAKT2 mRNA病灶組織620.84±0.121.23±0.26癌旁組織621.60±0.211.22±0.27t值8.51713.251P值0.0000.000

2.2兩組NDRG2、AKT2及p-AKT2水平比較：肝癌病灶組織中NDRG2蛋白水平，低于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)；肝癌病灶組織中AKT2、p-AKT2蛋白水平，高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2兩組NDRG2、AKT2及p-AKT2水平比較

組織類型例數NDRG2AKT2p-AKT2病灶組織626.71±0.6714.24±2.4118.50±1.25癌旁組織629.47±1.249.28±0.6812.49±1.08t值10.3955.6819.386P值0.0000.0000.000

3 討論

NDRG2屬于是一種低表達基因，在多種惡性腫瘤或細胞系中表達水平相對較低，但在人中樞神經系統的大腦皮質、白質與神經核中表達水平相對較高，在骨骼干細胞或精細胞中表達水平相對較低，能直接參與細胞的增殖[6]。臨床研究表明，NDRG2能抑制惡性腫瘤細胞系，是一種抑癌基因。國內學者研究表明，NDRG2在肝細胞癌組織中表達水平相對較低或不表達，與腫瘤的發生、發展、轉歸存在緊密的聯系。而PI3K-AKT信號轉導通路在肝癌的發生、發展中發揮了重要的作用。本研究中，肝癌病灶組織與癌旁組織AKT2 mRNA水平差異無統計學意義(P>0.05)；肝癌病灶組織中NDRG2 mRNA水平，低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；肝癌病灶組織中NDRG2蛋白水平，低于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)；肝癌病灶組織中AKT2、p-AKT2蛋白水平，高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)，說明NDRG2與AKT2、p-AKT2蛋白在肝癌組織中表達異常，均能參與肝癌的發生、發展，能反映疾病的嚴重程度，與臨床病理具有相關性。因此，臨床上加強AKT2、p-AKT2、NDRG2測定能評估患者預后，指導臨床治療，利于患者恢復。

綜上所述，NDRG2在肝癌組織中呈低表達，而p-AKT2在肝癌組織中呈高表達，二者呈負相關性，均能參與疾病的發生、發展。