結合珠蛋白基因多態性與HBV相關性肝細胞癌易感性的關系分析

楊海嬌，楊廣民

(1.長春中醫藥大學，吉林 長春 130117；2.吉林省人民醫院醫學檢驗中心，吉林 長春 130021)

HBV呈世界性流行，其在機體中的長期存在，是肝癌發生發展的重要條件。Hp是一種酸性糖蛋白，主要合成于肝臟，廣泛存在于人類的血清及其他體液中[1]。人類Hp主要存在3種基因型：Hp1-1型、Hp2-1型和Hp2-2型[2]。由于Hp的基因多態性，近些年以Hp列為靶點探究其與疾病的關系，進而分析疾病病因及發病機制已成為一個重要課題。現選取在吉林省人民醫院治療的HBV-HCC患者，以健康體檢者作為對照，對所有受檢人員Hp基因型進行檢測，以探究Hp的基因多態性與HBV感染相關肝癌的關系，現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:隨機選取2019年3月至12月在吉林省人民醫院治療的HBV-HCC患者98例，男81例，女17例，平均年齡61歲。納入標準：①年齡>18歲；(2)肝癌符合《中國肝癌診治指南》中的診斷標準，慢性乙型肝炎符合《慢性乙型肝炎防治指南》中的診斷標準。排除標準：①合并有HCV、HIV、梅毒、肝吸蟲等其他病毒或寄生蟲感染；②有嚴重心、肺、腎等重要臟器疾病。同時選取健康體檢者104例作為對照。

1.2設備和試劑: Thermo Heraeus Fresco 17冷凍微量離心機，ABI PCR System 9700 PCR擴增儀，引物合成參照文獻[3]，上游引物F1：5′-GCTGTCACTGCTGCGTAAAG-3′；下游引物R1：5′-GGTCAGTCTTTGGTTGGGTAG-3′；上游引物F2：5′-CCTGCCTCGTATTAACTGCACCAT-3′；下游引物R2：5′-CCGAGTGCTCCACATAGCCATGT-3′；由吉林省庫美生物科技有限公司合成特異性引物，PCR擴增試劑盒由北京Promega生物技術有限公司提供，DNA提取試劑盒由天根生物工程股份有限公司提供，DNA Marker 由日本Takara公司提供。

1.3實驗方法

1.3.1DNA提取和檢測:留存HBV-HCC患者及健康體檢者EDTA抗凝全血2 ml，嚴格按照DNA提取試劑盒說明書的操作要求從全血中提取基因組DNA。保存至-20℃條件下待用。

1.3.2PCR擴增PCR反應體系:應用PCR技術特異性擴增目的基因，體系包括模板DNA 2 μl，擴增緩沖液及DNA聚合酶12.5 μl，10 μM上下游引物mix 2 μl，加入無核酶水補至25 μl。第1步用上游引物F1和下游引物R1擴增Hp1的1757 bp產物和(或)Hp2的3481 bp產物，第2步用上游引物F2和下游引物R2擴增Hp2特異性的349 bp產物。引物F2和R2與引物F1和R1擴增體系相同。反應條件：引物F1和R1擴增時，95℃預變性2 min，95℃變性1 min，69℃退火并延伸2.5 min，共35個循環，末次循環后72℃充分延伸10 min，冷卻至4℃。引物F2和R2擴增反應條件同上。

1.3.3Hp基因型的判定:取PCR擴增產物7 μl，依次點樣于0.8%瓊脂糖凝膠加樣孔中，并點樣相匹配的DNA Marker。電壓100 V，電泳40 min。應用Tanon1600R全自動數碼凝膠圖像分析系統，在紫外燈下檢測并攝像，通過觀察電泳圖，進行Hp基因型分型。

1.4統計學方法:基因計數法計算出等位基因頻率。采用SPSS 21.0統計學軟件，應用卡方分析處理分析數據。

2 結果

HBV-HCC患者組Hp1-1基因型頻率為18.37%，Hp2-1為38.78%，Hp2-2為42.86%；健康人組Hp1-1基因型頻率為7.69%，Hp2-1為34.62%，Hp2-2為57.69%。兩組間Hp1-1基因型頻率差異有統計學意義(P<0.05)；HBV-HCC組Hp1基因頻率為37.76%，Hp2基因頻率為62.24%；健康人組為25.00%，Hp2基因頻率為75.00%。等位基因Hp1的基因頻率升高明顯，且兩組間有顯著性差異，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1104例健康人與HBV感染相關肝癌Hp基因頻率比較[例(%)]

基因型例數(頻率)健康人HBV-HCCχ2值P值Hp1-18(7.69)18(18.37)6.9050.032Hp2-136(34.62)38(38.78)Hp2-260(57.69)42(42.86)總Hp152(25.00)74(37.76)7.6500.006總Hp2156(75.00)122(62.24)

3 討論

HBV的持續感染與肝癌密切相關。HBV是一種雙鏈DNA病毒，其能將DNA整合入宿主細胞基因組內，從而誘發原發性肝細胞癌[4]。另外HBV會激發人體產生過度的細胞免疫反應，導致大規模的肝細胞損傷和嚴重肝炎。而此時患者的細胞免疫功能較弱，無法迅速有效得清除病毒，可能導致慢性感染，進而增加轉變成肝癌的風險[5]。

Hp由一條含有439個氨基酸殘基的單一多肽鏈組成。與免疫球蛋白的四肽鏈結構相似的是，Hp也含有兩條輕鏈(α鏈)和兩條重鏈(β鏈)，輕鏈又分為α1和α2兩種，是使Hp具有基因多態性的主要原因。Hp有Hpl和Hp2兩種等位基因，位于常染色體16q22上。人類Hp的3種基因型的分布存在種族和地區的差異性。在我國漢族人中，Hp2-2型最多，占55%左右；其次為Hp2-1型，約占35%；Hp1-1型最少，約10%左右。臨床上針對Hp基因構造、表達、基因多態性研究尚不完善，僅討論了等位基因Hp2在HBV-HCC中表達明顯增高[6]。鑒于等位基因Hp2與HBV感染的相關性，考慮Hp基因多態性可能與HBV-HCC存在一定的關聯，故將兩者進行研究對比。而本次實驗發現，HBV-HCC患者組Hp1-1基因型頻率為18.37%；健康人組Hp1-1基因型頻率為7.69%。兩組間Hp1-1基因型頻率差異有統計學意義(P<0.05)；HBV-HCC組Hp1基因頻率為37.76%，Hp2基因頻率為62.24%；健康人組為25.00%，Hp2基因頻率為75.00%。等位基因Hp1的基因頻率升高明顯，且兩組間差異有統計學意義(P<0.05)。這意味著與健康人相比Hp1基因在HBV-HCC患者中更為聚集，而不是等位基因Hp2。考慮可能有以下三種原因：(1)Hp1基因攜帶者對HBV-HCC有著更強的易感性；(2)在肝臟疾病中，癌前病變時Hp1基因就已經發生了集聚現象，這需要進一步研究來證實。(3)本次實驗數據大多來源于吉林省患者，有一定的局限性，需要更多的數據來證明這一結論。

綜上所述，等位基因Hp1與HBV-HCC有一定的關系，其存在可能更容易促使慢性乙型肝炎患者發展至肝癌階段，需要更進一步的研究來完善這其中的發生發展機制。