煙草BELL基因家族鑒定及其溫室條件下的表達模式分析

宋衛娜，趙森森，武明珠，王根發，羅朝鵬，王 晨，李澤鋒，楊 軍，王 中*

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號 450001

2.鄭州大學生命科學學院，鄭州高新技術產業開發區科學大道100號 450001

3.河南中煙工業有限責任公司技術中心，鄭州市經濟技術開發區第三大街9號 450000

植物TALE（Three amino-acid loop extension）基因家族編碼一類包含同源異型盒結構域的轉錄因子，其DNA結合域由63個氨基酸組成，形成2個螺旋與3個額外氨基酸（P-Y-P）的非典型結構［1-2］。根據序列和進化上的差異，植物TALE基因家族可進一步被分為BELL（BEL1-like homeodomain）和KNOX（KNOTTED1-like homeobox）兩個亞家族。KNOX基因主要參與細胞分化和莖尖分生組織的維持［3-4］，而BELL基因在胚珠發育、葉狀體發育、干細胞維持和分化中起著重要作用［5-7］。

BELL基因家族存在于所有生物體中，但不同植物中該基因家族成員數目不同。例如，苔蘚基因組中有 4個BELLs基因［8］，擬南芥有13個［5］，玉米有15個［9］，而水稻和土豆各有14個［10-11］。雖然BELL基因家族的數目不同，但其編碼的蛋白在結構上具有高度保守性，都包含SKY、BEL和HD功能域［12］。這3個功能域的高度保守對維持植物BELL的功能具有重要意義。研究表明，SKY和BEL功能域能夠與KNOX蛋白的MEINOX結構域進行特異性識別和結合，從而形成BELL-KNOX異源二聚體蛋白［13］，這種結合對兩種轉錄因子蛋白的核定位和結合靶基因序列的活性至關重要［14-16］。BELL-KNOX二聚體形成后會從細胞質轉移到細胞核中，隨后兩個蛋白的HD功能域識別并特異結合到各自的靶基因序列上，從而實現對下游靶基因表達水平的調控［2，17］。與此同時，BELL-KNOX二聚體蛋白還能與其他轉錄因子互作。例如，與MADS-Box轉錄因子和SPOROCYTELESS蛋白結合，共同調控胚珠的發育［18-19］；與OVATE蛋白結合后，BELL-KNOX二聚體蛋白能夠從細胞核反向轉移到細胞質中［20］。多種具有不同活性的異源BELL-KNOX二聚體組合參與調控植物的生長發育，包括莖尖分生組織及其邊界的維持、葉片發育、開花等［20-23］。在擬南芥中，BELL家族的BLH1蛋白能夠與KNOX家族的KNAT3蛋白結合形成BLH1-KNAT3二聚體，通過調控脫落酸（ABA）信號通路相關基因的表達而影響種子的發芽和生長［14，20］。BELL 家族的ATH1蛋白與 KNOX 家族STM蛋白形成的二聚體能夠調控植物頂端分生組織的發育［15］，而ATH1蛋白和KNAT2蛋白形成的二聚體則調控植物花序組織的發育［24］。

雖然已在多種植物中鑒定出了BELL基因，但大多數基因的功能仍未十分明確。目前，關于BELL基因功能的研究主要集中在模式植物擬南芥中，鮮見煙草BELL（NtBELL）基因的報道。根據煙草基因組數據庫，利用生物信息學的方法，通過檢索SKY、BEL和HD功能域鑒定出煙草基因組中的BELL基因后，對煙草BELL家族成員的序列特征、進化關系和表達模式進行分析，以期為進一步研究煙草BELL基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

供試材料為普通栽培煙草紅花大金元（Nicotiana tabacum L.）。煙草種子于2017年3月播種于MS培養基上，待幼苗長至4片真葉時，移栽到小盆缽中。移栽后的幼苗種植在國家煙草基因研究中心溫室，溫室條件為28℃光照16 h，23℃黑暗8 h。待煙苗長至盛花期，分別收集根、莖、葉、頂芽、花蕾和花等樣品，經液氮速凍后于-80℃保存。

TransTaq?高保真Taq酶試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；反轉錄試劑盒（北京康潤誠業生物科技有限公司）；植物多酚RNA提取試劑盒、實時熒光定量試劑盒和凝膠回收試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）；限制性內切酶（大連寶生物工程有限責任公司）。引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成；其他常規試劑均為國產分析純試劑。

MM400混合型碾磨儀（德國Retsch公司）；Nanodrop 2000超微量分光光度計（美國Thermo公司）；C1000TMThermal Cycler熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 干旱和鹽脅迫處理

煙草幼苗在MS培養基上長至4片真葉時，選取長勢一致的幼苗分別移入含有0、1%和3%（質量體積比）NaCl的MS培養基上。正常條件下繼續培養1周，收取全株幼苗，液氮速凍后用于總RNA的提取。將幼苗從MS培養基移栽到盆缽中，溫室中生長，每周澆2次水，每次300 mL。待煙苗長至8片真葉時進行干旱處理，分別采集斷水后0、2、4和6 d的煙草葉片［25-26］，液氮速凍后用于總RNA的提取。

1.2.2 RNA提取和反轉錄

采用植物多酚RNA提取試劑盒提取煙草各組織RNA，實驗操作嚴格按照產品說明書進行。在提取過程中，加入RNase-free DNase I消化可能殘留的基因組DNA。提取完成后，各RNA樣品的濃度和質量分別用Nanodrop 2000和瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。選擇質量檢測合格且濃度較高的RNA樣品用于cDNA第一鏈的合成，合成過程參照Gene Star M-MLV反轉錄試劑盒說明書。cDNA樣品的濃度經Nanodrop 2000檢測后，用ddH2O統一稀釋至40 ng/μL，-20 ℃保存。

1.2.3 生物信息學分析

以BEL1-like homeodomain protein為關鍵詞在中國煙草基因組數據庫V4.0中進行檢索，獲得所有普通煙草中的候選BELLs基因。隨后將所有候選基因編碼的蛋白序列導入到Pfam軟件（http：//pfam.xfam.org/search）中進行功能域分析，選擇同時包含SKY、BEL和HD功能域的基因作為煙草BELL家族基因。提取各NtBELLs基因的序列、染色體位置、外顯子個數、核苷酸長度、蛋白質長度、蛋白分子量、等電點等信息。利用DNAMAN V6.0比對煙草BELLs基因編碼蛋白的氨基酸序列，再利用 MEME 軟件（http：//meme-suite.org/）確定煙草BELLs基因3個保守功能域的氨基酸序列，用GSDS軟件（http：//gsds.cbi.p-ku.edu.cn/）分析基因的外顯子/內含子結構，并繪圖。

根據NtBELLs基因在煙草染色體上的位置信息，利用MapInsect軟件進行染色體定位和圖譜的繪制。用Clustal X軟件比對不同物種中BELLs基因編碼的氨基酸序列，比對完成后將結果導入MEGA5軟件中，用Neighbor-joining方法構建BELLs基因的系統進化樹。本研究中，用到其他物種的BELLs基因分別來自擬南芥（AtBEL10/AT1G19700、AtBLH5/AT2G27220、AtBLH3/AT1G75410、tBLH6/AT4G34610、AtBLH7/AT2G16400、AtBLH11/AT1G 75430、AtBEL1/AT5G41410、AtBLH4/AT2G23760、AtBLH2/AT4G36870、AtBLH1/AT2G35940、AtBLH8/AT2G27990、AtBLH9/AT5G02030、AtATH1/AT4G32 980）和馬鈴薯（StBLH5/PGSC0003DMP400010515、StBEL29/PGSC0003DMP400036956、StBEL11/PGSC 0003DMP400034115、StBEL13/PGSC0003DMP4000 17878、StBEL14/PGSC0003DMP400021824、StBEL22/PGSC0003DMP400038077、StBEL30/PGSC0003DMP 400053924、StBEL32/PGSC0003DMP400006695、StBE L33/PGSC0003DMP400041981、StBEL34/PGSC0003 DMP400014183、StBEL35/PGSC0003DMP400033253、StBEL6/PGSC0003DMP400052181、StBEL31/PGSC 0003DMP400006694）。

1.2.4 基因表達分析

利用熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術檢測煙草NtBELLs基因在根、莖、葉等不同組織和脅迫條件下的表達，引物見表1。在冰上配制qRT-PCR反應體系：10 μL 2×SYBR Green Master、3 μL cDNA 模板（40 ng/μL）、上 下 游 引 物（10 μmol/L） 各 1 μL、5 μLddH2O，充分混勻后瞬時離心。qRT-PCR反應程序采用兩步法，即95℃ 3 min；95℃ 10 s，60℃30 s，信號采集，45個循環。反應結束后運行溶解曲線程序（65～95℃）。以3株長勢相近的煙草葉片作為1個獨立的生物學重復，每個組織共設置3個生物學重復。qRT-PCR反應結束后，采用2-ΔCT或 2-ΔΔCT方法計算NtBELLs基因的相對表達量［27］。

表1 NtBELLs基因引物Tab.1 Primers of NtBELL genes

2 結果與分析

2.1 煙草BELLs基因的鑒定

在中國煙草基因組數據庫V4.0中，用BEL1-like homeodomain protein作為關鍵字進行檢索后，共獲得28個可能的BELLs基因。通過Pfam功能域分析發現，28個煙草BELLs基因均包含典型的SKY、BEL和HD結構域，屬于BELL基因家族成員。由表2可知，NtBELLs基因含有3～8個外顯子，大多數含有4個。NtBELL基因的編碼區在1 299～2 289 bp之間，編碼432～762個氨基酸，蛋白質分子量在48.81～82.99 kDa之間，等電點為4.88～9.15。

兩兩比對NtBELLs基因編碼區序列和氨基酸序列的相似性（表3），根據相似性的高低，將NtBELLs基因分為15組，分別命名為NtBELL1～NtBELL15。其中，NtBELL7和NtBELL15各有1個拷貝，而其他NtBELLs基因都有兩個相似性很高的拷貝。

2.2 煙草NtBELLs基因的染色體定位及進化分析

由圖1可知，除3個定位在scaffold上的NtBELLs基因（Ntab0312290、Ntab0471080和 Ntab0547850）外，其余25個煙草NtBELLs基因分別分布在15條不同的染色體上。其中，7和22號染色體上分布的BELLs基因最多，各有3個。NtBELL8基因的兩個拷貝（Ntab0734150和Ntab0815520）都分布在10號染色體上，而且二者序列相似性為100%，推測可能由染色體復制產生。NtBELL4和NtBELL5基因的兩個拷貝都分別分布在5和22號染色體上，且相鄰在一起，表明二者之間可能存在一定的連鎖性。

表2 普通煙草中BELLs的基因信息Tab.2 Information of BELL genes in Nicotiana tabacum

圖1 NtBELLs基因在染色體上的分布Fig.1 Chromosome location of NtBELL genes

為進一步明確煙草BELL基因家族成員的進化關系和可能的生物學功能，根據煙草、擬南芥和馬鈴薯BELLs基因編碼的氨基酸序列，構建BELL基因家族的系統進化樹。由圖2可知，BELL基因家族被分為4個組，即BELL-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。煙草NtBELL基因在4個組上的分布較為均勻，如BELL-Ⅰ和Ⅲ各有6個NtBELLs基因，BELL-Ⅱ有9個，BELL-Ⅳ有7個。擬南芥、馬鈴薯已有的BELLs基因功能研究結果表明，不同組的BELLs基因可能具有不同的生物學功能［11，13-15］。推測 BELL-Ⅰ組中的NtBELL1、NtBELL4和NtBELL5蛋白可能主要作為OVATE家族蛋白的伴侶發揮功能；BELL-Ⅱ組中NtBELL2、NtBELL3、NtBELL6、NtBELL7和 NtBE LL8蛋白主要參與根的生長；BELL-Ⅲ組中的BELLs蛋白主要參與分生組織的發育；BELL-Ⅳ組中的NtBELL14和NtBELL15蛋白可能參與調控胚珠的形態發育，而NtBELL11和NtBELL12蛋白則可能參與葉片的形態發育［1，11，15，28-29］。

2.3 煙草NtBELLs基因的結構及蛋白結構域分析

圖2 BELL基因家族系統進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of BELL gene families in plants

煙草28個NtBELLs基因的長度差異非常大，最長的基因（Ntab0312290）有11 259 bp，而最短的基因（Ntab0844240）只有1 786 bp，大多數基因的長度在3～5 kb之間（圖3）。典型的煙草NtBELLs基因由3個內含子和4個外顯子組成，且外顯子的長度（尤其是第2和第3個外顯子）比較保守。NtBELL1、NtBELL2、NtBELL5、NtBELL8～NtBELL13 基因均包含4個外顯子，其中第2個外顯子的長度在322～400 bp之間，第3個外顯子長度在61 bp左右。其他NtBELLs基因的結構則是在此基礎上發生了內含子的插入，形成更多的內含子和外顯子結構。例如，NtBELL3基因的第1、2和4號外顯子中間分別插入了1個內含子，形成了6個內含子和7個外顯子的結構。不同NtBELLs基因同一內含子的長度差異很大，同一NtBELL基因的不同內含子長度也有較大的差異。不同NtBELLs基因中，第1個內含子的長度為300～3 000 bp；NtBELL14基因所有內含子的長度在92～4 700 bp之間。NtBELLs基因內含子長度的差異可能與基因的選擇性剪切有關。

比對煙草NtBELLs蛋白的氨基酸序列后發現，有兩個保守性很高的區域（圖4A），分析發現其分別包含BELLs蛋白的3個典型功能域，即SKY、BEL和HD。用MEME軟件進一步分析這3個功能域在所有煙草NtBELLs蛋白中的保守氨基酸（圖4B），發現保守性最高的是HD功能域。3個功能域在NtBELLs基因上的分布位置也非常保守，SKY分布在第1和第2個外顯子上，BEL和HD功能域連在一起，分布在第2、3和4個外顯子上。

2.4 煙草NtBELLs基因的表達模式分析

檢測了NtBELLs基因在普通煙草盛花期根、莖、葉、花蕾、花和果實中的表達水平（圖5）。幾乎每個NtBELLs基因都有兩個拷貝（除NtBELL7和NtBELL15），引物設計時很難將同一基因的不同拷貝區分開，因此選擇在基因保守區段設計兩個拷貝的通用引物。在煙草根、莖、葉、花蕾、花和果實等組織中都能檢測到NtBELLs基因的表達，但是不同組織中NtBELLs基因的表達量有明顯差異。在根中，NtBELL2、NtBELL3和NtBELL7基因的表達水平明顯高于其他NtBELLs基因；在莖中，表達量最高是 NtBELL1、NtBELL2、NtBELL8和 NtBELL13基因；在葉中表達量最高的是NtBELL11和NtBELL12基因；在花中，NtBELL5、NtBELL6、NtBELL11 和NtBELL12基因的表達水平均較高；而在果實中表達水平最高的是NtBELL14和NtBELL15基因。基因表達水平的巨大差異預示著不同的NtBELLs基因可能在煙草各個組織發育中發揮著不同的生物學功能。

圖3 煙草NtBELLs基因的外顯子和內含子Fig.3 Exons and introns of NtBELL genes

圖4 煙草NtBELLs蛋白功能域分析Fig.4 Functional domain analysis of NtBELL proteins

圖5 不同組織中NtBELLs基因的表達水平Fig.5 Expression levels of NtBELL genes in different tobacco tissues

為探究NtBELLs基因在煙草抵御環境脅迫過程中的功能，分別檢測了NtBELLs基因在干旱和鹽脅迫處理條件下的表達水平。如圖6所示，大多數NtBELLs基因的表達水平在干旱條件下沒有明顯變化。與0 d相比，NtBELL2基因的表達水平在干旱處理2 d時升高了兩倍，隨后一直保持在兩倍以 上 的 水 平 。 NtBELL4、NtBELL8、NtBELL10和NtBELL13基因的表達水平都是在干旱處理4 d時開始升高，6 d時達到更高的水平。其中，NtBELL8基因的表達水平在6 d升高了3倍，是所有基因中變化量最大的。干旱脅迫誘導NtBELL8基因的表達水平顯著上調，表明其可能參與了煙草的抗旱過程。

NaCl脅迫處理實驗發現，不同濃度NaCl對煙草NtBELLs基因表達水平的影響不同。1%NaCl脅迫處理下，所有NtBELLs基因的表達水平都沒有明 顯 變 化 ，但 是 NtBELL2、NtBELL3、NtBELL6、NtBELL13和NtBELL15基因的表達水平在3%NaCl處理條件下被明顯上調（圖7），尤其是NtBELL6基因的表達水平被上調了3倍。

3 討論

圖6 干旱條件下煙草NtBELLs基因的表達水平Fig.6 Expression levels of NtBELL genes under drought treatment

圖7 NaCl脅迫下煙草NtBELL基因的表達水平Fig.7 Expression levels of NtBELL genes under NaCl stress

研究表明，多基因家族各成員之間的功能往往會發生明顯的分化，系統分析基因家族各成員的序列特征、進化關系、表達模式等可為研究其功能提供指導［30-32］。AtBELLs各成員分別參與了不同組織器官的分化。如AtBLH2（AT4G36870）和AtBLH4（AT2G23760）在擬南芥的葉片、莖、花藥等多個組織中表達，在atblh2atblh4的雙突變體中，KNOX家族的BP（BREVIPEDICELLUS）基因異位表達，導致突變體葉片呈現卷曲的鋸齒狀［5，33］。而AtBLH8（AT2G27990）和AtBLH9基因（AT5G02030）的突變體表現出花序節間異常，角果畸形簇生，表明二者能夠調控擬南芥花序原基的生長［17，34］。根據擬南芥［13-15］、玉米［9］、馬鈴薯［11］等已有的同源基因研究信息，本研究中對煙草NtBELLs各成員的功能進行了初步的劃分（圖2）。NtBELL9、NtBELL10和NtBELL13基因與擬南芥AtBLH8和AtBLH9基因的親緣關系較近，推測NtBELL9、NtBELL10和NtBELL13基因可能參與調控煙草分生組織；NtBELL11和NtBELL12基因與AtBLH2和AtBLH4基因聚類在一起，表明可能與煙草葉片發育有關；NtBELL2、NtBELL3、NtBELL6、NtBELL7和 NtBELL8基因與ATBLH、StBELL5、StBELL11等基因的同源性較高，表明可能參與根的生長及通過調控ABA信號影響種子萌發和幼苗的形態建成［11，14］；NtBELL14和NtBELL15基因與擬南芥AtBEL1基因的親緣關系很近，后者被證實能夠通過調控激素信號影響擬南芥胚珠的發育［19，35］。隨后，基因的表達模式分析也在一定程度上證實了NtBELLs基因功能的同源預測。例如，與葉片發育有關的NtBELL11和NtBELL12基因在葉片中的表達水平最高，與根生長相關的NtBELL2、NtBELL3和NtBELL7基因在根中的表達水平明顯高于其他基因，而與胚珠發育相關的NtBELL14和NtBELL15基因則只在果實中有較高表達。因此，結合同源基因比較和基因表達模式分析，初步確定了煙草各NtBELLs基因的功能，為后續研究NtBELLs調控煙草植株發育提供參考和依據。

同時，還發現干旱和NaCl脅迫能夠顯著誘導部分NtBELLs基因的表達，表明該基因家族可能參與了植物抵御非生物脅迫的過程。研究發現，玉米中一些脅迫響應相關基因的表達可能分別受多個ZmBELLs的調控［9］，但目前尚沒有BELLs基因改變植物抗性的報道。因此，NtBELLs基因調控煙草組織發育和抗性還需進一步驗證。

4 結論

通過同源比對和功能域分析，從普通煙草基因組中共鑒定出28個BELLs基因，根據其序列相似性及進化關系，分別將其命名為NtBELL1～NtBELL15。所有NtBELLs基因編碼的蛋白都包含SKY、BEL和HD功能域，3個功能域的序列及在基因上的分布位置都高度保守。系統進化分析表明，煙草NtBELLs基因被明顯分為4組，每組中的NtBELLs參與了煙草不同的發育過程。NtBELLs基因在不同煙草組織中的表達模式與基因功能預測基本一致。部分NtBELLs基因的表達水平受干旱和NaCl脅迫誘導，表明BELL基因家族可能在煙草抵御非生物脅迫過程中發揮重要作用。