雞細小病毒與H9 亞型禽流感病毒三重PCR 檢測方法的建立*

李丹， 謝芝勛，李孟，謝麗基，羅思思，張艷芳，張民秀，黃嬌玲，范晴，王盛，謝志勤，鄧顯文，曾婷婷

（廣西壯族自治區獸醫研究所廣西獸醫生物技術重點實驗室，廣西 南寧 530001）

雞細小病毒（chincken parvovirus，ChPV）為一種無囊膜單鏈DNA 病毒，由三個（NS、NP 和VP）開放閱讀框組成。ChPV 是一種能引發雞群發生腸道疾病的重要病毒之一， 在臨床上主要引起雞精神抑郁、腹瀉、生長遲緩和料肉比增加等[1]。 1983年， 細小病毒首次在發生腸炎的發育不良的火雞中發現[2]。 1984 年，匈牙利科學家Kisary 等人用電鏡在雞的糞便樣品中觀察到細小病毒顆粒， 隨后這些發現被基因組序列測定進行確定[3-4]。 關于ChPV 的流行病學調查顯示其在商品肉雞的感染率較高，蛋雞或種雞次之[5]。 該病毒普遍地存在于某些雞群中，主要以雛雞為侵害對象，會造成患病雞的腹瀉及發育不良， 有研究表明在發育障礙與矮小綜合征雞群的血清中檢測到了ChPV DNA[6]。近年來該病毒相繼在北美、 東歐及亞洲的多個國家地區[7-9]有發現報道，證明ChPV 在全球多個國家的雞群中普遍存在。

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）屬于甲型流感病毒， 由于其最易發生變異以及近年來禽流感病毒的跨種傳播而受到人們的關注[10]。 依據不同AIV 毒株對雞致病性的強弱， 可以將AIV分為高致病性AI（HPAIV）、低致病性AIV（LPAIV）和非致病性AI（NPAIV)。H9亞型AIV 屬于LPAIV，家禽感染發病后臨床癥狀多表現為輕微的呼吸道癥狀，同時還會造成蛋雞的產蛋率下降、肉雞的生長發育遲緩等；野禽、水禽和家禽攜帶該病毒時大部分不表現出任何明顯的臨床癥狀， 但會對機體造成一定的損傷， 是目前影響我國養禽業發展的重要禽類病毒病之一[11]。 H9N2亞型AIV 最早于1966 年在美國威斯康辛州的火雞中被分離到[12]。我國廣東地區于1994 年首次在AIV 引起發病的雞體內發現H9N2亞型AIV[13]。 研究表明H9亞型AIV 容易與其他病原（病毒和細菌等）混合感染加重疾病造成的損失； 其還可以與其它不同亞型的AIV 混合感染，并在宿主體內發生基因片段重組，產生一些不可預知的新型流感病毒， 進而可能引起大流行。 H9亞型AIV 可以跨種屬屏障感染人類，上世紀90 年代末以來多次發生H9N2亞型AIV感染人的事件，特別是對2013 年以來引起人感染的H5N6、H7N9和H10N8亞型AIV 的基因來源分析中發現其內部基因均來自H9N2亞型AIV[14-16]。 由上述報道可見，H9N2亞型AIV 與ChPV 都對家禽養殖業造成了嚴重的危害。

由于ChPV 很難在正常雞胚和細胞中增殖培養，目前僅依靠PCR 技術直接檢測腸道內容物或泄殖腔棉拭子樣品中是否存在目標病原的核酸，進而判斷樣品有無該病原體的感染。目前，禽流感病毒的診斷方法較多， 其中最常用的是分子生物學方法，特別是PCR 檢測方法，其具有簡便、敏感性高及特異性好的優點而得到廣泛應用。近年來，由于多重PCR 診斷技術隨著科技的發展而不斷完善，同時只有對多種病原體混合感染的優點，而且可以大大縮短對混合樣品進行逐項檢測的時間， 已經被成熟應用于多種動物病原混合感染的診斷。 為此，本研究根據H9亞型AIV HA 基因、所有AIV 的M 基及ChPV 的NS 基因的保守序列，設計3 對針對兩種病毒的特異性引物，建立了ChPV與H9亞型AIV 三重PCR 檢測方法， 不僅可以快速準確地鑒別上述兩種不同病原的混合感染，而且為ChPV 與H9亞型AIV 的有效防控提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 試劑包括： 購自北京全式金生物技術有限公司的試劑有2×PCR Super Mix，DNA/RNA 共提試劑盒、 小量質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、感受態細胞、PCR 產物快速連接載體和DNA Marker；購自寶生物（北京）有限公司的試劑有M-MLV、 隨機引物、dNTP 及RNA抑制劑；其它試劑均購自商業公司。 儀器包括：購自美國Bio-Rad Laboratories 公司的PCR 儀，購自美國Thermo 公司的超微量分光光度計。

1.1.2 毒株 毒株（H1N2、H3N2、H6N2、H9N2、H9N6、NDV、IBV、ARV、ILTV、ChPV、Adv4、RTV、aMPV、CAV、AHEV 和MDV） 均由廣西獸醫生物技術重點實驗室保存；H7N2亞型AIV 的cDNA 模板由美國賓夕法尼亞州立大學惠贈；H5N1亞型AIV 的cDNA 模板由美國康涅狄格州立大學惠贈； 其它AIV（H2N3、H8N4、H10N3和H11N3）毒株或cDNA 模板均由香港大學惠贈。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計和合成 運用DNAStar 軟件將GenBank 中 下 載 的ChPV NS 基 因、AIV M 基 因 和H9亞型AIV HA 基因的核苷酸序列進行比對，分別對三種目的基因進行特異性保守區域的篩選，采用Primer6.0 和Oligo6.0 軟件設計特異性引物，并通過NCBI BLAST 在線驗證其特異性， 篩選出分別針對三種目的基因的3 對特異性引物。 設計出的引物序列見表1。 上述引物均由賽默飛廣州分公司合成。

表1 引物序列

1.2.2 病毒RNA/DNA 的提取與RNA 的反轉錄 參照試劑盒使用說明書， 運用 DNA/RNA 抽提試劑盒對試驗中所用到的AIV、NDV、IBV、ARV、ILTV、ChPV、Adv4、RTV、aMPV、CAV、AHEV和MDV 的DNA/RNA 進行抽提，并用33μL DEPC水溶解抽提后的DNA/RNA。 參照反轉錄酶說明書對RNA 病毒的抽提產物進行反轉錄合成cDNA，所有產物置-30℃保存。

1.2.3 三重RT-PCR 反應體系及條件的優化 該方 法 的PCR 反 應 體 系 為25μL：2×TransTaq-T PCR SuperMix 12.5μL， 作 為 模 板ChPV DNA 和H9亞型AIV cDNA 各加入1μL，再分10 個梯度各加入0.1～1.0μL 對引物ChPV-F 、ChPV-R、H9-F、H9-R、M-F 和M-R (25pmol/μL)進行濃度的優化，最后用超純水將反應總體積補足至25μL。 為最終確定最佳的反應體系及條件根據實驗效果對退火溫度及時間進行優化。

1.2.4 特異性試驗 為驗證所建立的三重RTPCR 檢測方法的特異性， 運用該法將H1N2、H2N3、H3N2、H5N1、H6N2、H7N2、H8N4、H9N2、H9N6、H10N3、H11N3、NDV、IBV、ARV、ILTV、ChPV、Adv4、RTV、aMPV、CAV、AHEV 和MDV 的RNA/DNA 按照優化好的反應條件進行檢測。 對擴增出的目的片段進行純化回收， 連接到載體pMD18-T 上并轉化到感受態細胞（DH5α）中進行克隆，挑選陽性單克隆菌送賽默飛廣州分公司進行測序驗證。

1.2.5 標準品的制備 分別以ChPV DNA 與H9N2亞型AIV cDNA 為模板， 用特定的引物對ChPV NS 基因、AIV M 基因和H9N2亞型AIV HA基因的全長片段進行PCR 擴增，得到其ChPV NS基因、M 基因和HA 基因的全長目的片段，再分別將這三個基因片段連接到pMD18-T 的載體中并轉化到感受態細胞（DH5α）中進行克隆，挑選陽性單克隆菌送賽默飛廣州分公司進行測序驗證。 將含有ChPV NS 基因、AIV M 基因和H9亞型AIV的HA 基因片段的3 種重組質粒分別命名為NST、M-T 和H9-T。 用質粒抽提試劑盒提取NS-T、M-T 和H9-T 的質粒，并用微量核酸檢測儀對其進行核酸濃度的測定， 根據分子質量和核酸濃度計算對應的拷貝數， 將NS-T、M-T 和H9-T 等拷貝數混合，并進行10 倍倍比稀釋，以得到NS-T、MT 和H9-T 質粒DNA 濃度均 為5×109～5×101拷貝/μL 的標準品。

1.2.6 敏感性試驗 為檢測該方法的敏感性，運用所建立的ChPV、AIV M 基因和H9亞型禽流感病毒三重RT-PCR 的檢測方法對NS-T、M-T 和H9-T 質粒濃度為5×107～5×102拷貝/μL 的樣品進行特異性擴增。

1.2.7 臨床樣品檢測 對活禽市場采集的130 份雞咽喉及泄殖腔拭子運用建立的三重PCR 檢測方法進行檢測鑒定， 同時將病料處理后接種SPF雞胚進行病毒分離鑒定， 并進行HA 基因全長擴增。 同時經ChPV NS 基因陽性PCR 產物和HA 基因全長克隆送測序公司進行測序， 然后將上述結果進行比較，驗證三重RT-PCR 的檢測結果。

2.2 結果與分析

2.2.1 三重RT-PCR 條件的優化 通過對ChPV NS 基因、AIV M 基因和H9亞型AIV HA 基因3 種引物濃度的測定及擴增溫度時間等的優化，最終確定三重PCR 最佳反應體系：2×TransTaq-T PCR SuperMix 12.5μL，ChPV DNA 和H9亞型AIV cDNA 各1μL 作 為 模 板， 引 物H9-F 和H9-R(25pmol/μL)各加入0.5μL，引物ChPV-F 和ChPVR(25pmol/μL)則分別加入0.8μL，引物M-F 和M-R(25pmol/μL)則分別加入0.8μL，最后用超純水補足至25μL。 最終優化的反應條件為：95℃5min；進入95℃ 30s，56℃ 45s，72℃ 45s，共35 個循環；然后再72℃延伸10min，最后4℃結束反應。

2.2.2 特異性試驗 該法對ChPV 及H9亞型AIV混合感染樣品能檢測出3 條特異性的條帶， 分別為551bp （ChPV）、249bp （AIV M 基 因 通 用）及378bp（H9亞型）；對ChPV 檢測結果僅出現1 條特異性條帶， 片段大小為551bp； 對H9N2與H9N6亞型AIV 進行擴增檢測出2 條特異性條帶， 片段大小分別為378bp 和249bp；對其他亞型AIV 出現1條特異性249bp 條帶， 其它常見的禽病病原體均未擴增出任何條帶， 結果表明該方法具有良好的特異性。 特異性結果見圖1。

2.2.3 敏感性試驗 運用該方法針對5×107～5×102拷 貝/μL 的ChPV NS、AIV M 基 因 和H9亞 型AIV HA 基因的質粒模板進行擴增，結果顯示，對濃度為5×107～5×104拷貝/μL 的ChPV NS 基因、AIV M 基因和H9亞型AIV HA 基因質粒均可擴增出3 條明顯的特異性條帶，片段大小分別為551bp、249bp 和378bp； 對濃度等于或小于5×103拷貝/μL 的ChPV NS 基因、AIV M 基因和H9亞型AIV HA 基因質粒均無擴增條帶。 由此可見，該法最低能檢測到5×104拷貝/μL 的ChPV NS 基因、AIV M 基因和H9亞型AIV HA 基因質粒。 敏感性結果見圖2。

2.2.4 臨床樣品檢測 運用該方法對廣西獸醫生物技術重點實驗室從南寧活禽市場采集的130 份雞口腔及泄殖腔的棉拭子樣品進行了檢測， 檢測結果顯示：有2 份樣品能同時擴增出551bp、249bp和378bp 的目的條帶， 為ChPV 和H9亞 型AIV 混合感染陽性； 有6 份樣品能同時擴增出378bp 和249bp 的目的條帶，為H9亞型AIV 單一感染陽性；13 份樣品僅能擴增出551bp 的目的條帶，為ChPV單一感染陽性；3 份樣品僅能擴增出249bp 的目的條帶， 為除H9亞型外的H3和H6亞型AIV 感染。同時對上述樣品進行病毒分離鑒定和HA 基因測序，其結果與三重PCR 檢測結果100%相符，說明該方法具有一定的實用性。 部分臨床樣品檢測結果見圖3。

3 討論

研究表明， 雞的腸道性疾病例如病毒性腹瀉給養雞業造成了嚴重的經濟損失， 其中引起雞腸炎及腹瀉等癥狀ChPV 在臨床上也經常檢出[17]。另外， 在出現神經癥狀和活動障礙的肉雞群中也檢測到ChPV 感染，臨床還存在ChPV 隱性感染或者與其它病毒及細菌混合感染的情況， 進而引起生長發育受阻，出現“僵雞”及飼料料肉比下降等[18]。另外由于ChPV 引起的臨床癥狀與其它病毒較相似，且在臨床上極易呈現出混合感染的病例，給臨床上鑒別診斷帶來困難。 研究還發現ChPV 具有垂直傳播的潛在可能， 可能造成種蛋的孵化率下降及雞胚發育吸收不良的情況增加。ChPV 疫苗研發的最大障礙是其在細胞和雞胚上不能大量增殖， 現在還沒有有效的商品化疫苗防治ChPV 感染。 目前，國內雖然沒有關于ChPV 暴發和流行的相關報道， 但是本實驗室在對廣西地區不同品種和日齡雞群監測的結果表明ChPV 在某些品種和日齡雞群的感染率依然很高。 因此，對于ChPV 的監測及防控也是十分迫切和必要的， 建立一種快速的鑒別診斷方法可以為該病的監測及防控提供有力的技術支撐。

H9亞型禽流感是目前對家禽養殖業危害最為嚴重的疾病之一，其在全球各個地方均有發生，而H9N2亞型AIV 在我國雞群中流行最為廣泛。 H9N2亞型AIV 可以跨越種屬屏障直接感染人類， 嚴重威脅人類公共健康的安全。 AIV 基因組由8 個獨立節段組成，分別為HA、NA、M、PB1、PB2、PA、NP和NS[19]。 由于AIV 抗原在自然條件容易發生變異，臨床上易導致新的AIV 亞型出現，而且會發生多種亞型AIV 的混合感染， 其引起的癥狀又極其相似，給精確鑒別診斷造成了巨大的困惑。 在AIV的所有基因片段中，HA 基因的變異最頻繁， 同時也是變異最大的， 因此HA 基因的分型鑒定引物根據其變異而不斷的進行更新。 M 基因因其保守性更強，經常被用來設計AIV 通用引物。

由于經典的病毒分離鑒定方法存在檢測鑒定禽流感病毒的周期較長， 而常用的血清學方法則需要較多不同亞性標準陽性血清且不同亞型血清之間的抗原存在不同程度的血清學交叉反應，因此這些傳統檢測方法均存在不同程度的局限性。分子生物學特別是PCR 檢測方法對AIV 進行鑒定與分型目前最常用的檢測方法， 也是WHO 與OIE 推薦的方法之一[20]。 該方法快速準確、操作簡便、平均樣品檢測成本相對較低，得到了廣泛的認可與應用推廣。 近年來，國內外已有檢測ChPV 和AIV 的PCR 診斷技術和方法的研究， 而且多重PCR 技術在不同禽病混合感染診斷中的應用越來越多[21-24]。 本研究建立H9亞型AIV 與ChPV 三重PCR 檢測方法可以快速診斷和鑒別H9亞型AIV或者ChPV 單獨和混合感染。 我們建立方法的特異性試驗結果顯示， 多種亞型AIV 和ChPV 混合感染時依然能特異擴增出目的基因的條帶； 敏感性試驗的結果表明，當兩種病毒混合感染時，該方法依然能夠清晰擴增出兩種病毒的目的基因片段； 臨床試驗結果說明建立的H9亞型AIV 和ChPV 三重PCR 檢測方法能夠直接進行臨床樣品的檢測， 為臨床上兩種不同疾病的快速鑒別和診斷提供了良好的技術支撐。

4 結論

本試驗通過優化三重PCR 反應條件， 成功建立雞細小病毒、禽流感病毒M 基因和H9亞型禽流感病毒三重PCR 檢測方法，該方法能夠快速準確的鑒別ChPV、AIV 與H9亞型AIV， 為多種疾病的

有效防控提供技術支撐。