掌葉覆盆子誘導培養的抗褐化研究

王云冰，江景勇,2

(1.臺州科技職業學院 園藝植物研究所，浙江 臺州 318020； 2.臺州市農業科學研究院，浙江 臺州 317000)

掌葉覆盆子(RubuschingiiHu)又稱華東覆盆子，俗稱大號角公、牛奶母等，為薔微科懸鉤子屬，葉形多為五裂似掌狀。掌葉覆盆子是“藥果同源”植物，成熟果可食用，未成熟果實可入藥，是194種懸鉤子屬植物中唯一入選《中國藥典》的覆盆子，具有益腎、固精、縮尿、養肝明目等功能，有著極大的開發潛力和廣闊的市場前景。掌葉覆盆子種苗繁育多采用扦插、壓條和根蘗繁殖等[1]，但繁育效率低，品種易混雜。通過組培快繁育苗不僅能保證品種純正，還能快速高效提供優質種苗，以滿足市場需求。

掌葉覆盆子組織培養中外植體褐化現象較普遍。外植體褐化是一種酶促褐變，多酚氧化酶被激活，從而使植物體中的酚類物質聚合產生的醌類物質，從而影響離體材料的現象[2]。褐化是導致外植體培養材料死亡的主要原因，這直接影響到種苗的繁育及成本[3]。在不同培養基成分中，采用抗氧化劑及吸附劑，其外植體的褐化程度表現各異[2]。大花香水月季、牡丹、芍藥等在組培上已有較系統的抗褐化研究[4-6]，而掌葉覆盆子主要針對建立相應的各階段培養基配方研究較多[1,7-8]，有關褐化問題的研究鮮見報道。

外植體褐化受取材部位及培養基類型的影響。吸附劑和抗氧化劑等抗褐化劑會減輕外植體的褐化程度，常用的有抗壞血酸(Vc)、檸檬酸、活性炭(AC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等[3]。低溫預處理對降低褐變有一定作用[7]。本試驗通過對掌葉覆盆子莖段組織培養中不同的外植體部位、培養基、抗褐化物質及低溫黑暗等處理，對掌葉覆盆子的抗褐化方案進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

選取臺州地區優良掌葉覆盆子進行組培，選取根蘗芽段、帶芽枝段、當年生莖段為外植體。不同試驗材料取材時間為3月10日至7月10日。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

將采取的掌葉覆盆子材料在肥皂水中用軟毛刷清洗，然后在自來水中沖洗1 h。將根蘗芽或枝條剪成長約2 cm的帶芽莖段，枝芽直接消毒，用75%的酒精浸泡搖動處理50 s，無菌水沖洗3次，再用0.1%的升汞溶液浸泡震動8 min，無菌水沖洗3次，備用。

1.2.2 培養條件

光照強度2 000～4 000 lx，每天光照12 h，培養室溫度(25±2) ℃，培養基蔗糖用量30 g·L-1，瓊脂用量6 g·L-1，pH為5.8，培養基使用的激素種類和用量為6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。

1.2.3 處理設計

不同外植體試驗。培養基為1/2MS，T1、T2、T3處理分別為帶芽枝段、根蘗芽段和當年生莖段，采集時間分別為3、4、7月。T4、T5、T6 4 ℃低溫處理時間分別為0、24、48 h，材料為莖段。

不同培養基處理。將莖段切去兩端接種于不同基礎培養基上，分別為T7(1/4MS)、T8(1/2MS)、T9(MS)、T10(WPM)。

不同抗褐化劑處理[4-5]。培養基為1/2MS，處理T11、T12、T13對應加入Vc濃度分別為50、100、150 mg·L-1；處理T14、T15、T16對應加入PVP濃度分別為1、2、3 g·L-1。

1.2.4 測定指標

培養基采用單因素試驗，每處理20個外植體，重復3次。外植體接種10 d后統計褐化率、出芽數，接種20 d后進行生長勢評價。褐化致死外植體個數計為褐化數；側芽萌發外植體個數計為萌發數；生長勢評價指標包括芽長、葉數、葉色、葉形等，從低到高共1～5級，3次評價取平均值[4]。

2 結果與分析

2.1 外植體不同取材部位培養對抗褐化的影響

掌葉覆盆子外植體不同部位取材培養的生長狀況差異較大。由圖1可見，根蘗芽段直徑較大，組織較嫩，褐化程度最高，褐化發生在3 d后，之后多數組織全部褐化；帶芽枝段頭尾部分褐化，生長停滯；而當年生枝段長出新芽，生長旺盛。

圖1 外植體不同部位培養生長情況

由圖2可見，生長勢評價表明，當年生莖段最佳，帶芽莖段其次，且兩者相差不大，而根蘗芽段最差；從出芽后生長后期可知，對帶芽莖段和當年生莖段芽生長影響不大，但對根蘗芽段后期生長仍有影響。從褐化情況看，根蘗芽段褐化率達到87.7%，帶芽枝段居中，當年生莖段最低，為14.8%；當年生莖段出芽率達到85.2%，帶芽枝段為45.3%，根蘗芽段最低，這也許與幼嫩組織酚類含量高有關。木本植物褐化發生與外植體體內酚類物質的含量呈正相關[9-10]，而帶芽莖段為冬季休眠莖段，少量褐化對其生長也有一定影響，而采自7月生長季當年生莖段相對于前兩者生長力旺盛，褐化少，這與李煥秀等[9]得出的5月以后外植體的褐變率逐漸降低的結論一致。

圖2 外植體不同部位培養抗褐化情況

2.2 不同基本培養基對外植體抗褐化的影響

從表1可以看出，在其他培養基條件相同的情況下，掌葉覆盆子外植體莖段在4種不同基礎培養基上長勢有所不同。其中，1/4MS培養基褐化率最低，為14.3%，出芽率為85.7%；1/2MS培養基褐化率與之相近；MS培養基褐化率最高，為47.1%，出芽率為52.9%，而WPM培養基與其接近。從生長勢評價來看，1/4MS培養基后期生長葉色略黃，生長芽心抽生速度慢，而其他三類培養基在出芽后生長較為穩定，生長旺盛，葉色濃綠。綜合來看，1/2MS培養基較為理想，這與李純佳等[4]研究的大花香水月季在WPM培養基中褐化率最低有所不同，但在MS培養基最高這點上是一致的，這可能與植物種類培養特性差異有關系。

表1 不同培養基條件下外植體抗褐化情況

2.3 抗褐化劑對抑制外植體抗褐化的影響

通過兩種抗褐化劑的不同水平處理觀察掌葉覆盆子外植體在培養基上的生長情況可知(圖3)，在不同濃度的抗壞血酸(Vc)處理中，T12處理Vc含量為100 mg·L-1時，褐化率僅為7.5%，出芽率達到92.5%；結果顯示，褐化情況隨著濃度升高呈先下降后上升趨勢。不同濃度PVP處理中，T14中PVP含量為1 g·L-1時褐化率最低，為15.0%，出芽率為85%；PVP濃度升至3 g·L-1時，其生長遲滯，葉片黃綠，芽細弱，生長勢有所下降，這與李純佳等[4]的研究結果一致。總體上講，Vc作為抗氧化劑對于掌葉覆盆子抗褐化效果較為明顯，作用濃度為100 mg·L-1，而通過吸附起作用的PVP為其次，作用濃度為1 g·L-1最佳。

2.4 黑暗低溫處理時數對外植體抗褐化的影響

圖4顯示，在不同黑暗低溫處理下，24 h黑暗低溫處理效果明顯，其褐化率僅為5.0%，出芽率高達95%，而未進行黑暗低溫處理的材料褐化率有34.0%，處理48 h的掌葉覆盆子材料其褐化率較之有所提升，后期生長勢觀察評價表明，黑暗低溫處理48 h的生長勢受到一定影響，出芽速度慢，葉片展開較慢，生長勢弱，而前兩者處理在出芽后的生長中長勢均較為良好。可見，適度的黑暗低溫處理對掌葉覆盆子抗褐化培養比較重要，以24 h為宜，處理時間過長對生長不利。

圖4 不同黑暗低溫處理時間下外植體生長情況

3 小結

試驗發現，選擇適宜的外植體部位，不同的基本培養基、抗褐化劑及黑暗低溫處理都對掌葉覆盆子抗褐化有一定的減緩作用，但通過某一因素的調節均不能對外植體褐化起到絕對的抑制作用，這與外植體褐化發生影響因素較多有關。植物組培褐化的發生與植物基因型、外植體及培養條件等內外因因素有關[3]。在不同部位的外植體培養中，當年生莖段褐化率低，僅為14.8%，生長勢評價等級為5級，長勢較佳；同等激素水平下，雖然前期1/4MS培養基褐化率略低，但權衡考慮生長勢評價情況，最佳基礎培養基配方應為1/2MS，其褐化率為15.0%。不同抗褐化劑處理結果顯示，掌葉覆盆子莖段對Vc 100 mg·L-1的培養基抗褐化效果最好，而PVP 1 g·L-1時抗褐化效果較好，褐化率為15%，濃度增加對生長不利，這與李萍等[5]的結果一致，實際操作中考慮出芽后轉接至新的培養基中為宜。黑暗低溫處理最佳時間為24 h，出芽率達到95%，超過24 h對其生長勢影響較大，原因可能與長期低溫造成植物組織損傷有一定關系[4]。

綜上所述，通過各單因素試驗，基本得出掌葉覆盆子減輕褐化的基本方法，有一定的實際意義。但以上試驗表明，沒有一種單因素足以使其外植體褐化率降至0，這需要綜合考慮幾個因素的疊加、協同效應，有待于進一步的多因素試驗。