利用沸石吸氨氮機理解決預混合飼料中維生素B1 測定的準確度研究

李 蘭， 賈 錚， 肖志明， 索德成， 劉志英， 郭紅雙， 徐思遠， 田 靜， 樊 霞

（1.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所 國家飼料質量監督檢驗中心（北京），北京100081；2.中牧股份有限公司，北京100070）

沸石是一簇架狀結構的含水硅酸鹽礦物（李日強等，2008）， 構成其骨架的最基本結構是硅氧（SiO4四面體和鋁氧AlO4）四面體。 沸石構架中有發達的孔穴、 孔道并具有色散力和靜電力兩種作用力，故具有較強的吸附性。 同時天然沸石因骨架中含有可交換的陽離子而具有離子交換樹脂特性（張英俊等，2008）。維生素B1在預混合飼料中極易受到各種因素如水分、溫度、微量元素、氯化膽堿等的影響而降解（單安山，2001）。 利用沸石的這一性質，可將維生素B1吸附于框架中，以達到穩定、免遭降解的目的。 但同時也給檢測技術帶來了難題， 即如何從沸石吸附的框架中有效的提取目標維生素成為檢測技術的關鍵。

唐登勇等（2010）發現，天然沸石對NH4+具有很好的選擇吸附性， 即使在有干擾陽離子Ca2+、Mg2+存在時，仍顯示出良好的脫氨效果。 利用這一特性， 在優化了維生素B1的液相色譜分離條件后，嘗試采用銨類化合物作為預混料的提取劑， 利用沸石對銨根離子優先選擇吸附的性質，達到置換硫胺根的目的。 本試驗以沸石及其他多孔結構的無機載體為基質，添加一定量的維生素B1， 制備一定濃度的氯化銨溶液作為提取劑，提取基質中的維生素B1。 通過建立氯化銨濃度與測定維生素B1回收率之間的關系， 證明氯化銨可用作解吸附劑釋放吸附在沸石結構中的維生素B1，確定滿足解吸附效率時氯化銨的濃度以及用量，并通過對市場搜集樣品的測定，進一步驗證試驗結論。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Aglient 1100 高效液相色譜儀備二極管矩陣檢測器：美國安捷倫公司；電子分析天平（精度0.0001 g）：德國Sartorius 公司；帶溫控pH 計（精度0.01）：德國Lab 公司；超聲波提取器，美國Branson 公司；高速離心機（轉速8000 r/min）：美國Sigma 公司；針頭過濾器0.45 μm（或0.2 μm）濾膜：美國安捷倫公司。

標準品維生素B1（硝酸硫胺素， 純度大于99%）：美國Sigma—Aldrich 公司；氯化銨（優級純），庚烷磺酸鈉（PICB7，優級純），冰乙酸（優級純），三乙胺（色譜純），二水合乙二胺四乙酸二鈉（EDTA，優級純）：國藥集團化學試劑公司；甲醇（色譜純）：美國Fisher 公司；水：Milli—Q Gradient 超純水。

1.2 標準溶液和提取溶液的配制 取硝酸硫胺素標準品（純度大于99%），置于干燥器中干燥24 h。稱取0.01 g（精確至0.0001 g），溶解于酸性20%乙醇溶液中并定容至100 mL，該溶液含0.1 mg/mL維生素B1，可根據需要稀釋成系列標準溶液。

提取液： 取107 g 氯化銨溶解于1000 mL 水中，用2 mol/L 鹽酸調節溶液pH 為3 ～4；取900 mL氯化銨溶液與100 mL 甲醇混合。

1.3 樣品前處理 稱取試樣約3.0 g （精確到0.001 g），置于100 mL 棕色容量瓶中，加入提取液約70 mL， 邊加邊搖勻后置于超聲水浴中超聲提取30 min，冷卻，用提取液定容至刻度，搖勻。取少量溶液于離心機上8000 r/min 離心5 min，上清液過0.45 μm 微孔濾膜，上HPLC 測定。

1.4 色譜條件 日本島津ODS 3V C18色譜柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；柱溫為室溫；進樣量20 μL；流速為1 mL／min。檢測器為紫外檢測器或者二極管矩陣檢測器，波長242 nm；流動相為庚烷磺酸鈉溶液（0.005 mol/L，pH 3.7）-甲醇（80：20），V／V。1.5 統計分析 應用Excel 軟件進行數據統計計算。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化 由于水溶性維生素是一大類有著相似結構及性質的物質， 從液相色譜分離角度， 無論測定哪一種維生素， 其他均為干擾項。因此，在色譜條件的考慮上首先需要將幾種水溶性維生素的分離度優化至滿意， 才可以準確測定某一種維生素。如果選擇等度淋洗，則需要利用添加了離子對的體系才可以滿足分離度要求。

在選擇離子對試劑時， 烷基鏈的長度是必須考慮的因素， 因為碳鏈的長度決定了對樣品的分離程度。碳鏈越長，對離子的疏水性越強。 試驗采用庚烷磺酸鈉作為離子對試劑， 通過添加冰乙酸調節流動相pH 為3.7，使得6 種水溶性維生素的色譜得到較好的分離，并通過添加三乙胺，改善了堿性物質的拖尾，使得色譜峰尖銳好看。6 種維生素的分離情況如圖1 所示。

2.2 樣品前處理條件的優化 對于復合預混合飼料，測定維生素B1長期以來存在回收率不達標的現象。 國家標準GB/T 14700-2002 “飼料中維生素B1的測定”中采用14%甲醇水（pH 3.2）作為流動相，并用此流動相進行樣品提取。在選擇不同預混合飼料樣品（飼料樣品來自于企業的商品飼料）進行試驗與標示值進行對比計算回收率，發現大多未達到要求（表1）。

表1 14%甲醇水（pH 3.2）提取復合預混合飼料回收率結果

從對預混料的檢測結果看，回收率為50% ～122%，多數樣品的回收率未達到85%。在逐一排除造成回收率低下的原因，如微量元素、抗氧化劑、各類藥物、鹽類后，將試驗重點落在載體的選擇上。 最終的結果顯示，在有沸石存在時，目標化合物回收較低， 而且回收率隨沸石量增加而降低。

明確了由于沸石的吸附作用導致維生素B1提取出現困難這一問題后，解決吸附成為關鍵點。如何與硫胺素競爭沸石的多孔結構是解決問題的關鍵。 受沸石吸附氨氮機理的啟發 （高俊敏，2001）， 天然沸石對NH4+具有很好的選擇性吸附作用（唐登勇，2010），常用于處理污水達到凈化目的（張英俊等，2008）。 試驗遴選有機銨類化合物、無機銨類化合物，如氯化銨、磷酸二氫銨、四水合鉬酸銨、 草酸銨、N-N 二甲基甲酰銨作為進取劑進行對比分析發現， 使用相同用量時以氯化銨效果最佳。

為考察不同用量氯化銨對沸石解吸附的影響， 在不同重量的沸石中混入相同濃度的維生素B1， 后經10%甲醇水提取15 min， 上液相色譜測定，從沸石中回收維生素B1的回收率（表2）。

表2 氯化銨用量對沸石解吸附的影響

結果表明，對于預混料而言，其中沸石含量越多，在料中占的比例越大，氯化銨解吸其中的維生素B1能力也會隨著下降。因此需要增加氯化銨使用量以滿足需要。 增加有機相對微量元素有某些抑制作用，而且會減少色譜分析中的溶劑效應。選擇10%的甲醇與10%酸性氯化銨 （pH 約為4.0）溶液混合做為提取劑可以獲得比較滿意結果。 通過對實際樣品的測定，當預混料中維生素B1含量為50 ～1200 mg/kg 時，回收效果較好（表3）。

表3 實際樣品測定結果

2.3 方法線性方程和定量限 制備維生素B1標準儲備溶液，精密移取一定量的維生素B1稀釋成一組標準系列， 使維生素B1含量為0.1 ～45.0 μg/mL，進樣測試。 以濃度為X 軸，峰面積為Y 軸繪制曲線，建立相關線性方程。 如表4 所示。

表4 線性方程

選取空白基質1%奶牛預混料進行定量限以及2 倍定量限添加回收實驗，按照噪音理論，定量限15 mg/kg， 該定量限以及2 倍定量限下的回收率大于95%。

結果表明，在優化的色譜條件下，維生素B1濃度在0.1 ～45.0 μg/mL 范圍內呈良好線性關系， 定量限也滿足復合預混料添加量范圍內的檢測需要。

2.4 回收率實驗 由于預混合飼料對于維生素B1很難找到空白料，因此實驗選擇了豬預混料、雞預混料、鴨預混料為測試樣本，在原樣品基礎上進行強化添加，回收率數據滿足要求。 結果見表5。

表5 強化添加回收率結果

3 討論

3.1 預混料中維生素B1穩定性與沸石的吸附性能 沸石晶格內部開放性很大，除了有（Al、Si、O）四面體從角頂相互連結，形成架狀硅鋁氧骨干外，還有很多大小均一的孔穴和通道， 孔穴通過開孔的通道彼此相通， 使得沸石具有巨大的比表面積（謝洪剛等，2006），因而具有強大的吸附性能。

沸石空間最基本的結構單位是硅氧（Si04）四面體和鋁氧（AIO）四面體。 其中1 個氧原子的價電子沒有得到中和， 使得整個鋁氧四面體帶一個負電荷，為了保持中性，鋁氧四面體附近必須有一個帶正電荷的金屬陽離子（M+）來抵消其所帶的負電荷（通常是堿金屬或堿土金屬離子）。 維生素B1活性成分硫胺素作為陽離子基團與氯離子或者硝酸根離子結合形成穩定的鹽。 也就是通常所說的鹽酸硫胺素或者硝酸硫胺素。 沸石一個特點就是對于SO2和NH3的吸附選擇性，使得維生素B1易于結合在多孔框架中穩定存在。

3.2 沸石所具有的離子交換性能與解吸附 沸石為一種無機離子交換樹脂， 具有交換陽離子的能力（謝洪剛等，2006），可以通過分子氨的吸附和離子氨的交換除去水中的氨氮（李日強等，2008）。由于NH4+的離子半徑為2.86 A。， 較容易進入4.00A。的沸石孔道。 高英俊等（2001）通過在溶液中引入NH4+離子而置換出被吸附的硫胺根離子成為可能。

本研究利用沸石對某些陽離子吸附和交換的原理， 建立了復合預混合飼料中維生素B1測定前處理方法。通過使用10%氯化銨甲醇提取復合預混合飼料，使得提取效率較14%甲醇水作為提取劑提高20%。通過添加回收實驗以及商品飼料的測定，證明了在有沸石做載體的預混合飼料測定其中的維生素B1時， 該方法測定的有效和準確性。