基于DNA QDs@PDA熒光共振能量轉移的半胱氨酸傳感器

陳飄飄　邢怡晨　劉洋　鄭姍　黃朝表

摘 要 建立了基于DNA 量子點（DNA QDs）與聚多巴胺（PDA）熒光共振能量轉移（FRET）檢測半胱氨酸的方法。DNA QDs發射的熒光被PDA分子吸收，發生FRET，導致DNA QDs的熒光猝滅，使DNA QDs處于熒光“關閉”狀態。當存在半胱氨酸時，從多巴胺（DA）向PDA的自發氧化聚合反應將被阻斷，使DNA QDs的熒光恢復，處于熒光“開啟”狀態，且DNA QDs熒光的恢復程度與溶液中半胱氨酸的濃度相關，基于此構建了半胱氨酸熒光傳感器。檢測半胱氨酸的線性方程為y=0.0181x-0.0185，線性范圍為10.0～100.0 μmol/L，檢出限為1.7 μmol/L（S/N=3，n=10），此傳感器對半胱氨酸具有良好的選擇性，常見氨基酸及生物硫醇小分子均無干擾。將本方法用于人尿樣中半胱氨酸的測定，回收率為98.6%～105.9%。

關鍵詞 DNA 量子點; 共振能量轉移; 聚多巴胺; 半胱氨酸

1 引 言

半胱氨酸（Cys）是人體必需的一種含巰基的氨基酸，人體內半胱氨酸的含量被認為是疾病診斷的重要指標。半胱氨酸缺乏可導致多種疾病，如兒童生長緩慢、頭發變色、水腫、嗜睡、肝損傷、肌肉和脂肪損失以及皮膚損傷等[1，2]。

目前，檢測半胱氨酸的常用方法有光電化學分析法[3，4]、比色法[5，6]、電化學分析法[7]、高效液相色譜法（HPLC）[8]和熒光分析法[9，10]。然而，因半胱氨酸本身無紫外吸收，故高效液相色譜法需柱前衍生后再進行測定，操作復雜，且衍生效果不佳; 光電化學分析法及電化學分析法耗時長; 比色法的靈敏度不高。熒光分析因具有靈敏度高、設備簡單、操作方便等優點而受到越來越多的關注。

量子點（QDs）因其獨特的光學特性、良好的水溶性和生物相容性等引起了研究者的關注[11，12]， 已廣泛應用于金屬離子[13]和生物小分子[14]測定及細胞成像[15]等領域。其中，無機金屬半導體量子點雖具有高量子產率和良好的光學穩定性，但重金屬（Pb＼，Te＼，Cd等）離子的高細胞毒性和潛在環境危害，使其應用受限[16]; 碳量子點（CQDs）表現出強光致發光、高化學惰性、良好的水溶性、低細胞毒性、優越的光穩定性等優點，且易實現綠色合成，是無機金屬半導體量子點的理想替代物[17]。最近，Guo等[18]在相對溫和的條件下通過DNA自組裝制備了一系列DNA量子點。研究證明，由于DNA量子點富含的胞嘧啶堿基對的堆疊可形成sp2碳樣中心，以此為發色團發射熒光，且同時克服了無機半導體量子點和CQDs的缺點[19～22]。

多巴胺（DA）是兒茶酚胺神經遞質，在弱堿性條件下可被空氣或溶解氧氧化成多巴胺醌，并可在水溶液中自聚合形成一系列具有不同分子量的低聚物。同時，多巴胺、多巴胺醌及其低聚物在溶液中自組裝，通過各種非共價鍵形成不同結構的組裝體，統稱聚多巴胺（PDA）[23]。因PDA較寬的紫外-可見吸收光譜，使其成為一種應用廣泛的熒光猝滅劑。Qiang等[24]研究了多巴胺納米球的熒光猝滅能力，發現猝滅能力與氧化石墨烯相當，猝滅作用是通過能量轉移或電子轉移實現的。近年來，基于PDA與染料標記的DNA的結合，已開發了DNA[25]、ATP[26]、癌細胞[27]等的測定方法。據報道，某些還原性物質的存在，可有效抑制多巴胺的自發氧化聚合，從而有效抑制熒光猝滅效應的發生[28]。Ma等[29]報道了一種基于染料標記的ssDNA與PDA之間發生的熒光共振能量轉移（FRET）效應，還原劑的存在使ssDNA的熒光恢復，建立了一種檢測還原劑的新型熒光分析方法。

本研究設計了一種基于DNA QDs@PDA的熒光共振能量轉移（FRET）的半胱氨酸熒光傳感器。PDA的NH2與DNA QDs的COOH之間的共價鍵作用可將DNA QDs組裝在PDA表面，并產生FRET，導致DNA QDs的熒光猝滅，使DNA QDs處于熒光“關閉”狀態; 而半胱氨酸存在時，可以有效地抑制從DA向PDA的自發氧化、聚合、自組裝，從而抑制DNA QDs與PDA之間的FRET，使DNA QDs處于熒光“開啟”狀態，實現了半胱氨酸的定量檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

RF-5301PC型熒光分光光度計、Kratos Axis ULTRA X射線光電子能譜儀（日本島津公司）; LZMBDA 950型紫外分光光度計（珀金埃爾默股份有限公司）; 1810D 型分析電子天平（德國賽多利斯公司）; JEOL-2100F型透射電子顯微鏡（TEM，日本電子株式會社）; Thermo NEXUS 670型傅里葉變換紅外光譜儀（美國賽默飛世爾公司）; Plus-E3-20TH超純水器（南京易普易達公司）

半胱氨酸（Cys）、葡萄糖（C6H12O6）、丙氨酸（Ala）、蛋氨酸（Met）、甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、瓜氨酸（Cit）、精氨酸（Arg）、鳥氨酸（Orn）、色氨酸（Try）、纈氨酸（Val）、組氨酸（His）、多巴胺鹽酸鹽（DA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、D，L-青霉胺（PA）、D-青霉胺（D-PA）、二硫蘇糖醇（DTT）、3-巰基丙酸（MPA）、2-巰基乙酸（MAA）、2-巰基乙醇（MCE）（分析純，阿拉丁公司）; 鮭精低分子量雙鏈DNA（Sigma-Aldrich公司）。實驗用水均為超純水。

2.2 DNA QDs的制備

采用水熱法制備DNA QDs[18]。將雙鏈DNA溶解于水中，配成2.5 g/L的溶液。將DNA溶液轉移到聚四氟乙烯（Teflon）襯里的高壓釜中，160℃水熱反應4 h，冷卻至室溫，即獲得DNA QDs。對DNA QDs進行形貌、成分以及光譜表征。

2.3 DNA QDs的熒光猝滅效應

將100 μL不同濃度（0.0、0.5、1.5、2.5、5.0、10.0和20.0 mmol/L）的DA溶液與400 μL 2.5 g/LDNA QDs溶液混合，并用10.0 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.7）稀釋至4.0 mL，超聲1 h后，測定熒光光譜和紫外-可見吸收光譜。另外，為了研究Cys對PDA導致的DNA QDs熒光猝滅的抑制作用，將不同濃度的Cys同時加入上述熒光猝滅體系中，測定熒光光譜。

2.4 半胱氨酸的測定

將不同濃度的Cys溶液與400 μL 2.5 g/L DNA QDs溶液混合，加入100 μL 2.5 mmol/L DA溶液，用Tris-HCl緩沖液稀釋至4.0 mL。反應1 h后，選擇激發波長為367 nm，發射波長為455 nm， 測定DNA QDs的熒光強度。

3 結果與討論

3.1 DNA QDs和PDA的表征

圖1A和1C分別為DNA QDs和PDA的透射電鏡 （TEM） 圖。DNA QDs和PDA在水中均具有良好的分散性，平均粒徑分別約為2.5 nm （圖1B）和10.2 nm （圖1D）。圖2A為DNA QDs的X射線光電子能譜（XPS）圖，位于284.57、405.82、531.42和139.72 eV處的譜峰分別為C1s、N1s、O1s和P2p特征峰。圖2B為高分辨率C1s光譜，在284.7、286.0、286.2和287.8 eV處的4個峰分別歸屬于CC、 CN、 CO和CO鍵。圖2C為高分辨率O1s光譜，在530.9、531.9、532.5和533.0 eV處的4個特征峰分別歸屬為PO-4、CO、 ON和CO[18，19]。圖2D為高分辨率N1s光譜，在399.9和398.7 eV處的特征峰可分別歸屬因于N和NH2。XPS表征結果證實，DNA QDs表面包含豐富的含氧和含氮基團。因此，DNA QDs可通過共價鍵結合組裝在PDA表面[30]。

3.2 DNA QDs@PDA的表征

由DNA QDs@PDA的TEM圖（圖3A）可見，DNA QDs@PDA在水中分散良好，平均粒徑約為14.4 nm（圖3B）。由圖3A可見，與DNA QDs相比，DNA QDs@PDA粒徑略有增大，證明DNA QDs結合在PDA表面。圖4中曲線a和b分別為DA和DNA QDs@PDA的紅外光譜圖， DA和DNA QDs@PDA在3500～3100cm-1均出現了NH和OH鍵伸縮振動的強吸收峰，以及2970和 2885 cm-1附近的CH鍵伸縮振動的弱吸收峰，且DNA QDs@PDA的吸收更強。另外，在500～1700 cm-1之間，吸收峰發生了很大改變，多巴胺分子的特征吸收峰幾乎完全消失，這是由于PDA和DNA QDs@PDA的生成導致DA分子的精細結構消失[33]，進一步證明DNA QDs@PDA的形成。

3.3 PDA和DNA QDs的光譜性質

圖5中曲線a、b和c分別為PDA的吸收光譜和DNA QDs的激發和發射光譜。DNA QDs最大激發波長為367 nm，最大發射波長為455 nm，發射藍色熒光。PDA在可見區有連續的吸收，可與DNA QDs發生FRET效應，導致DNA QDs的熒光猝滅[31]。

3.4 DNA QDs熒光猝滅及抗猝滅研究

3.4.1 pH值的影響 圖6A為pH值對DNA QDs熒光性能的影響。當pH=7.0～9.0時，DNA QDs的熒光強度基本不隨pH值變化。圖6B為DA對DNA QDs的熒光猝滅率隨pH值變化的曲線。結果表明，當pH=8.5時，基本達到猝滅平衡，故選擇Tris-HCl（10 mmol/L）緩沖溶液（pH=8.7）進行后續實驗。

3.4.2 DA濃度和反應時間對DNA QDs熒光猝滅的影響 隨DA濃度增大，對DNA QDs的熒光猝滅不斷增強，這是由于DNA QDs連接到PDA表面后，發生FRET所致[34]。當DA濃度為2.5 mmol/L時，猝滅率達最大。后續實驗選擇DA的猝滅濃度為2.5 mmol/L。 隨DA與DNA QDs反應時間延長，猝滅率持續增大，在60 min時基本達到猝滅平衡。選擇猝滅反應時間為60 min。

3.4.3半胱氨酸的抗猝滅效應 在pH 8.7的Tris-HCl緩沖液中，隨反應時間的延長，DA溶液的吸收增強，表明溶液中氧化產物和低聚物增加。當Cys濃度為0.0 μmol/L時，DNA QDs的熒光隨反應時間延長而持續降低，即猝滅效率不斷增強; 當Cys濃度為100.0 μmol/L時，DNA QDs的熒光強度基本不隨反應時間變化，即PDA對DNA QDs熒光的猝滅得以抑制。這是由于Cys的存在抑制了DA的氧化和聚合，從而抑制了DNA QDs@PDA體系的FRET效應，使DNA QDs處于熒光“開啟”狀態。

3.5 半胱氨酸的測定

在最佳實驗條件下，DNA QDs和DA（2.5 mmol/L）的混合體系中，隨著Cys濃度增加，DNA QDs熒光逐漸恢復（圖7A），且DNA QDs的熒光恢復率與Cys濃度滿足下述方程：

其中， F和F0分別為存在Cys和不存在Cys時DNA QDs的熒光強度，k為猝滅常數，c為Cys的濃度。

如圖7B所示，熒光恢復率與Cys濃度在10.0～100.0 μmol/L范圍內呈線性關系，線性方程為y=0.0181x-0.0185（R2=0.9962），檢出限（LOD）為1.7 μmol/L（S/N=3， n=10）。將本方法與文獻方法進行比較（表1），結果表明，本方法的靈敏度優于或相當于文獻方法。

3.6 熒光探針的選擇性

為了考察熒光探針對Cys的選擇性，選擇100 μmol/L Cys 與100 μmol/L氨基酸、生物硫醇小分子和葡萄糖等潛在干擾物質進行檢測。如圖8所示，這些氨基酸和葡萄糖對此熒光探針的干擾均可忽略，對DNA QDs的熒光光譜幾乎沒有影響。

3.7 實際樣品分析

利用DNA QDs@PDA熒光探針測定了人體尿液樣品中Cys含量。尿樣由兩名健康志愿者提供，對尿樣進行簡單的離心和過濾處理，采用本方法進行測定，測定結果如表2所示，加標回收率為98.6%～105.9%，表明本方法具有良好的實用性。

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Abstract A method for detecting cysteine based on fluorescenceresonance energy transfer （FRET） between DNA quantum dots （QDs） and polydopamine （PDA） was developed. Since the fluorescence emitted by DNA QDs was absorbed by the PDA molecule， FRET occurred， resulting in fluorescence quenching of DNA QDs， and leaving the DNA QDs in a fluorescent "off" state. In the presence of cysteine， the spontaneous oxidative polymerization from dopamine （DA） to PDA was blocked， the fluorescence of DNA QDs was restored， and the fluorescence was "on" state. Based on this， a cysteine fluorescence sensor was developed. The sensor had good selectivity to cysteine， and there was no interference between common amino acids and small biothiol molecules. The linear equation was y=0.0181x-0.0185 in linear range of 10.0-100.0 μmol/L. The limit of detection （LOD） was 1.7 μmol/L （S/N=3）. The method was successfully applied to determination of cysteine in human urine samples， with recoveries of 98.6%-105.9%.

Keywords DNA quantum dots; Fluorescence resonance energy transfer; Polydopamine; Cysteine