NaCl和NaHCO3混合鹽脅迫對(duì)馬藺幼苗生理特性的影響

袁澤斌，牟昌紅，王波，孫向麗,2,3*

(1.蘇州大學(xué) 建筑學(xué)院風(fēng)景園林系，江蘇 蘇州 215123； 2.蘇州市建筑與城市環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215123；3.蘇州大學(xué) 蘇州園科集團(tuán)建筑與城市環(huán)境協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 蘇州 215123)

鹽堿土在我國(guó)分布廣泛，嚴(yán)重制約著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。我國(guó)耕地鹽堿化面積超過(guò)760萬(wàn)hm2，占總耕地面積的1/5，主要分布在東北、華北及西北內(nèi)陸地區(qū)[1]。鹽堿土中的離子會(huì)抑制植物對(duì)養(yǎng)分的吸收[2]，還會(huì)提高土壤中重金屬的遷移能力[3]。采用植物改良的方式雖周期較長(zhǎng)，卻能從根本上改善土壤理化性質(zhì)，同時(shí)還能產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益，被認(rèn)為是最經(jīng)濟(jì)持久的方法[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物馬藺的種子由江蘇省沭陽(yáng)斗研種業(yè)有限公司提供。選取籽實(shí)飽滿，種皮完好的馬藺種子，在50 ℃以下的溫水中浸種3 d，期間每天更換水2～3次，最后1次換水時(shí)把生根粉倒進(jìn)去一起浸泡10 min，撈出晾干，然后播種在盛有石英砂和泥炭的基質(zhì)中，覆蓋薄膜，每3 d澆1次水，保持基質(zhì)處于濕潤(rùn)狀態(tài)，待幼苗長(zhǎng)至10 cm時(shí)，移栽至直徑10 cm的小花盆中，并用鹽溶液處理，每個(gè)小花盆中盛100 g基質(zhì)。

1.2 方法

1.2.1 幼苗的處理方法

試驗(yàn)于2019年3—4月在蘇州大學(xué)建筑學(xué)院栽培生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。將栽有馬藺幼苗的小花盆放置在規(guī)格相同的白色托盤(pán)中，每個(gè)托盤(pán)中放置相同數(shù)量的馬藺幼苗，以清水處理為空白對(duì)照，其余5個(gè)處理分別為0.30% NaCl、0.20% NaCl+0.10% NaHCO3、0.15% NaCl+0.15% NaHCO3、0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3五種鹽溶液組合(所有濃度均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))，分別將配制好的鹽溶液以每盆100 mL倒入托盤(pán)中，讓馬藺幼苗充分吸收鹽溶液，直至完全吸收。試驗(yàn)過(guò)程中，每7 d取1次樣，并給幼苗澆1次水，每處理幼苗80棵，為減小試驗(yàn)誤差，每次取樣時(shí)隨機(jī)選取15棵剪取幼苗葉片，每5棵為1個(gè)重復(fù)，每處理3個(gè)重復(fù)，共取樣5次，每次取樣完后剪取了葉片的幼苗棄用。

1.2.2 生理特性指標(biāo)測(cè)定

SPAD值的測(cè)定采用SPAD-502葉綠素儀，Pro含量測(cè)定采用磺基水楊酸比色法，可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法，SOD、POD、CAT酶活性的測(cè)定采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理與圖表的繪制，SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合鹽脅迫對(duì)馬藺幼苗葉片SPAD值的影響

SPAD值(綠色度)與葉子的葉綠素含量呈顯著正相關(guān)，可對(duì)葉片中的葉綠素水平提供可靠估計(jì)[9]。表1顯示，通過(guò)對(duì)鹽脅迫后的馬藺幼苗葉片的SPAD值的測(cè)定表明，在脅迫第7天時(shí)，各處理的幼苗葉片葉綠素含量未出現(xiàn)顯著差異。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照處理的幼苗葉片葉綠素含量呈顯著遞增趨勢(shì)，而其他處理均為先增長(zhǎng)后降低。在脅迫第21天時(shí)，除對(duì)照外，其余各處理的幼苗葉片葉綠素含量達(dá)到最大，而后呈下降趨勢(shì)。在脅迫第35天時(shí)，各處理葉綠素含量與對(duì)照相比均顯著降低，其中含量最低的為0.10% NaCl+0.20% NaHCO3處理的幼苗葉片，僅為28.90，較對(duì)照降低29.73%；其次為0.30%NaHCO3處理的幼苗葉片，為29.50，較對(duì)照降低28.28%；混合鹽中NaHCO3濃度越大，幼苗葉片中的葉綠素含量越低。

表1 不同鹽分組合對(duì)馬藺幼苗葉片SPAD值的影響

注：同列數(shù)據(jù)后無(wú)相同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著(P<0.05)。表2～3同。

2.2 混合鹽脅迫對(duì)馬藺幼苗Pro含量的影響

Pro積累與脅迫耐受性有關(guān)[10-11]。Pro被認(rèn)為是一種滲透調(diào)節(jié)劑，可保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激造成的損傷[12-13]。通過(guò)對(duì)鹽脅迫后不同時(shí)間馬藺幼苗葉片中Pro含量的測(cè)定(表2)表明，空白對(duì)照組的馬藺幼苗葉片中的Pro含量變化較穩(wěn)定，其余各處理隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)均呈先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)。在處理的第7天，經(jīng)0.3% NaHCO3溶液處理的幼苗葉片中Pro含量較其他處理已顯著上升，達(dá)到5.04 μg·g-1；第21天時(shí)含量達(dá)到最大，為7.34 μg·g-1，為空白對(duì)照的1.70倍；在第35天時(shí)，經(jīng)0.30% NaCl和0.20% NaCl+0.10% NaHCO3處理的幼苗葉片中的Pro含量較對(duì)照顯著下降，0.15% NaCl+0.15% NaHCO3、0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理中Pro含量仍顯著高于對(duì)照組。

表2 不同鹽分組合對(duì)馬藺幼苗葉片Pro含量的影響

2.3 混合鹽脅迫對(duì)馬藺幼苗可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其增加和積累能夠提高植物細(xì)胞的保水能力，對(duì)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用，也是篩選抗逆性的指標(biāo)之一[14]。通過(guò)對(duì)鹽溶液脅迫后不同時(shí)間馬藺幼苗葉片中可溶性蛋白含量的測(cè)定(表3)表明，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，CK處理的可溶性蛋白含量較穩(wěn)定，0.30% NaCl、0.20% NaCl+0.10% NaHCO3、0.15% NaCl+0.15% NaHCO3處理幼苗葉片中的可溶性蛋白含量表現(xiàn)出“下降、上升”的趨勢(shì)，而0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理則表現(xiàn)為“下降、上升、下降”的趨勢(shì)。在脅迫的第7天，可溶性蛋白含量最低的為0.30% NaHCO3處理，僅為0.238 mg·g-1，較0.30% NaCl、0.20% NaCl+0.10% NaHCO3處理顯著下降；第21天時(shí)，0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理的可溶性蛋白含量較其他處理顯著升高，分別達(dá)到0.273和0.285 mg·g-1；第35天時(shí)，可溶性蛋白含量最高的為0.30% NaCl處理的幼苗葉片，而0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理較其他處理顯著降低，推測(cè)原因可能是這兩個(gè)處理對(duì)幼苗的脅迫作用較強(qiáng)，導(dǎo)致可溶性蛋白逐漸降解。

表3 不同鹽分組合對(duì)馬藺幼苗葉片可溶性蛋白含量的影響

2.4 混合鹽脅迫對(duì)馬藺幼苗抗氧化酶系統(tǒng)的影響

2.4.1 SOD酶活性

植物的抗氧化酶系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、谷胱甘肽還原酶(GR)等多種酶類，是植物在遭受逆境脅迫時(shí)重要的防御體系[15]。各酶活性之間的平衡可將超氧自由基和H2O2維持在穩(wěn)定水平[16]。SOD是抗氧化酶系統(tǒng)中的第一道防線[17]，其作用是保護(hù)細(xì)胞免受超氧化物誘導(dǎo)的氧化脅迫[18]。通過(guò)對(duì)鹽脅迫后不同時(shí)間馬藺幼苗葉片中SOD活性的測(cè)定(圖1)表明，經(jīng)各鹽脅迫處理的幼苗葉片中的SOD的活性均始終高于空白對(duì)照組，0.30% NaCl、0.20% NaCl+0.10% NaHCO3、0.15% NaCl+0.15% NaHCO3處理隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)總體上呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢(shì)。在第35天時(shí)，SOD活性分別為第7天的1.72、1.56、1.70倍；在第28天時(shí)，0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理的SOD活性達(dá)到最大，其中0.30% NaHCO3處理的活性達(dá)到1 455.25 U·g-1，為對(duì)照的1.73倍；到第35天出現(xiàn)略微下降，說(shuō)明在鹽脅迫的過(guò)程中，馬藺幼苗可通過(guò)提高SOD的活性來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受超氧化物的影響。

圖1 不同鹽分組合對(duì)馬藺幼苗葉片SOD酶活性的影響

2.4.2 CAT酶活性

CAT廣泛存在于植物中，是一種包含血紅素的4聚體酶，在遭受逆境脅迫時(shí)，CAT主要負(fù)責(zé)清除光呼吸和脂肪酸β氧化過(guò)程產(chǎn)生的H2O2[19]。通過(guò)對(duì)鹽脅迫后的馬藺幼苗葉片中CAT活性的測(cè)定(圖2)表明，除空白對(duì)照組外，各處理幼苗葉片中的CAT酶活性都呈現(xiàn)出“上升、下降”的趨勢(shì)。其中，0.30%NaCl、0.20%NaCl+0.10%NaHCO3、0.15%NaCl+0.15%NaHCO3處理的CAT酶活性在脅迫第21天時(shí)達(dá)到最大，CAT活性最低的為0.20% NaCl+0.10% NaHCO3處理，0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理的CAT活性在脅迫第28天時(shí)達(dá)到最大，其中0.30% NaHCO3處理的酶活性達(dá)到380.97 U·g-1，為對(duì)照的1.31倍；在第35天時(shí)，各處理的CAT酶活性均較對(duì)照小，可能原因是在脅迫初始階段，幼苗體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的H2O2，CAT活性不斷升高以清除H2O2來(lái)維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，H2O2不斷積累，毒害植物細(xì)胞，致使CAT活性出現(xiàn)急劇下降。

圖2 不同鹽分組合對(duì)馬藺幼苗葉片CAT活性的影響

2.4.3 POD酶活性

POD可催化過(guò)氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過(guò)氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用[20]。通過(guò)對(duì)鹽脅迫后不同時(shí)間馬藺幼苗葉片中POD活性的測(cè)定(圖3)表明，在脅迫初期，各處理幼苗葉片中的POD活性均呈現(xiàn)出略微下降的趨勢(shì)；在第21天時(shí)，0.30% NaCl、0.20% NaCl+0.10% NaHCO3、0.15% NaCl+0.15% NaHCO3處理的POD活性急劇升高，最高的為0.30% NaCl處理，達(dá)到3 666.67 U·g-1，為空白對(duì)照組的2.00倍，而0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理在第28天時(shí)酶活性達(dá)到最大，分別為空白對(duì)照組的1.73和1.88倍；在第35天時(shí)，除0.10% NaCl+0.20% NaHCO3處理的POD活性較對(duì)照略高外，其余處理已降至低于空白對(duì)照的水平，原因可能為在初始階段，由于CAT活性的升高及在清除H2O2的過(guò)程中起到主導(dǎo)作用，隨著H2O2的不斷積累，CAT的作用有限，POD活性開(kāi)始升高，與CAT共同作用以清除細(xì)胞中的H2O2等有毒有害物質(zhì)，最終由于鹽脅迫作用的持續(xù)，導(dǎo)致POD活性也出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖3 不同鹽分組合對(duì)馬藺幼苗葉片POD活性的影響

3 討論

植物耐鹽的生理機(jī)制包括逃避鹽害和忍受鹽害兩種方式，滲透調(diào)節(jié)以及在抗氧化酶系統(tǒng)下參與的膜系統(tǒng)的保護(hù)，都屬于忍受鹽害的方式[21]。在鹽堿脅迫下，植物可以通過(guò)合成Pro、可溶性蛋白、醇類等有機(jī)調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)的滲透平衡，這些物質(zhì)還能起到穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)中酶分子活性構(gòu)象的作用[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，燕麥[24]、小麥[25]、玉米[26]等農(nóng)作物在遭受鹽脅迫時(shí)可積累Pro和可溶性蛋白來(lái)維持正常的生命活動(dòng)。本研究也發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫過(guò)程中，Pro和可溶性蛋白含量會(huì)有所提高，但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，Pro含量在脅迫后期有所下降，這與張明軒等[27-28]在研究NaCl對(duì)馬藺幼苗生長(zhǎng)的影響時(shí)所得出的結(jié)論相同。SPAD值可反映葉片中葉綠素的含量。本研究發(fā)現(xiàn)，在脅迫時(shí)間內(nèi)，葉片中的葉綠素含量呈先升后降的趨勢(shì)，這與劉文瑜等[29-30]在藜麥、樸樹(shù)和速生榆上的研究結(jié)果一致。植物耐鹽的生理機(jī)制是不同作用之間相互協(xié)作的，抗氧化酶的保護(hù)作用可與滲透調(diào)節(jié)同時(shí)存在。本研究中，馬藺幼苗在鹽脅迫作用下SOD活性會(huì)不斷升高，CAT活性會(huì)隨著SOD作用不斷產(chǎn)生H2O2而升高，POD的活性則會(huì)在CAT清除H2O2能力不足時(shí)升高。馬晶晶[21]在研究NaCl鹽脅迫對(duì)馬藺幼苗生長(zhǎng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，SOD的活性是先降后升的，原因可能是，其處理幼苗所用NaCl濃度為1.5%，為本研究的5倍，在高鹽脅迫下所表現(xiàn)出的酶活性變化和低鹽脅迫下有所差異。

本研究通過(guò)用單鹽和混合鹽對(duì)馬藺幼苗進(jìn)行脅迫發(fā)現(xiàn)，單鹽的脅迫作用總體上較混合鹽的脅迫作用強(qiáng)，且堿性鹽的脅迫作用較中性鹽脅迫作用強(qiáng)。白文波等[31]在研究NaCl和NaHCO3脅迫下馬藺生長(zhǎng)與光合特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，堿性鹽特有的高pH會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)的生理代謝紊亂，也證明堿性鹽脅迫強(qiáng)于中性鹽。劉丹等[32]發(fā)現(xiàn)，單鹽對(duì)狗棗獼猴桃幼苗的脅迫作用強(qiáng)于混合鹽，這與本研究結(jié)論一致，但其研究結(jié)果卻認(rèn)為，NaCl脅迫作用強(qiáng)于NaHCO3，原因可能為狗棗獼猴桃為大型藤本植物，對(duì)NaCl和NaHCO3的響應(yīng)機(jī)制不同。

本研究對(duì)馬藺幼苗的耐鹽機(jī)制做了生理上的初步探究，馬藺耐鹽基因值得深入研究。本研究采用的為基質(zhì)培養(yǎng)幼苗，澆灌鹽溶液的方式模擬鹽堿土，與真正的鹽堿土環(huán)境存在著一定的差別，所以在今后的研究中也要注重在實(shí)際中的應(yīng)用，為馬藺在鹽堿土改良方面的推廣提供可靠的依據(jù)。

綜上所述，通過(guò)本研究得出，在脅迫35 d中，各鹽溶液處理后的馬藺幼苗葉片的SPAD值和Pro含量均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，其中經(jīng)0.10% NaCl+0.20% NaHCO3和0.30%NaHCO3溶液處理的幼苗葉片的SPAD值在第35天時(shí)下降最顯著；在第21天時(shí)，Pro的含量在5個(gè)處理中也最多，這兩個(gè)處理的幼苗葉片中的可溶性蛋白的變化趨勢(shì)與其他處理也不完全相同，表現(xiàn)為“下降、上升、下降”的趨勢(shì)，而其余處理則為“下降、上升”；5個(gè)處理對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)中的各種酶活性的影響也存在較大的差別，在脅迫期內(nèi)，SOD活性總體呈上升趨勢(shì)，僅0.10% NaCl+0.20% NaHCO3和0.30%NaHCO3處理的幼苗葉片中SOD活性在第35天時(shí)出現(xiàn)略微下降，CAT和POD活性的變化趨勢(shì)則大體相同。由此可得，在單鹽中，堿性鹽的脅迫作用較中性鹽的脅迫作用強(qiáng)；混合鹽溶液中，堿性鹽的濃度越大，脅迫就越嚴(yán)重，除0.10% NaCl+0.20% NaHCO3鹽溶液組合外，單鹽的脅迫作用較另外兩個(gè)鹽溶液組合強(qiáng)。