尖吻蝮蛇毒組分I對人口腔鱗狀細胞癌HN4細胞凋亡及自噬的影響

黃婷婷，柴 琳，王振杰，俞 玲

0 引 言

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），簡稱口腔癌，惡性程度較高，約占頜面部惡性腫瘤的90%以上［1］。口腔癌的發病率在世界范圍內呈上升趨勢，雖然治療上已經取得了許多重要進展，然而口腔癌的發病率和死亡率仍居高不下，患者的生存質量及預后情況不理想［2］。因此，尋求一種新的、有效的治療方法是目前治療口腔鱗狀細胞癌的研究熱點。自噬和凋亡是兩個重要的細胞過程，是細胞對各種應激所致的細胞損傷做出應答。自噬是一種依賴溶酶體的降解途徑，是一種普遍存在的生命現象［3］，它是細胞降解的重要途徑［4-5］。自噬還參與多種病理生理過程。有研究表明，自噬的活性與腫瘤的發生密切相關［6-7］。因此，研究自噬發生的機制并有目的的干預，進而有效地控制自噬水平，對研究腫瘤的治療方法將會是一個新的突破。細胞凋亡是指機體細胞在受到內源性或外源性信號刺激時，凋亡控制基因程序被激活，經過多條信號通路傳遞的自殺性保護過程。線粒體凋亡途徑是細胞凋亡的重要途徑之一，是由線粒體介導的內源性凋亡途徑。有研究發現，高水平的自噬可能引起線粒體等細胞器的過度降解，并促進細胞死亡［8-9］。

尖吻蝮蛇毒組分I（component I from Agkistrodon Acutus Venom，AAVC-I）是將皖南五步蛇粗毒經過Cellulose DE-52 離子交換和Sephadex G-75 分子篩兩步層析后獲得的一種抑瘤組分，酸性蛋白質，相對分子質量為27 kD，研究表明AAVC-I 具有明顯的抑制腫瘤細胞增殖和促進凋亡的效應［10］。并且AAVC-I 在肺癌細胞及白血病細胞中可以通過線粒體凋亡途徑促進腫瘤細胞的凋亡［6-7］。本實驗研究探討AAVC-I 對人口腔鱗狀癌細胞的促凋亡作用及對自噬的影響，為今后口腔鱗癌的進一步研究和新藥研發提供有利的依據和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人口腔鱗狀細胞癌HN4 細胞來自于皖南醫學院病理生理教研室。胎牛血清購于美國Sigma 公司。AAVC-I 來自于皖南醫學院蛇毒研究所。MTT 試劑盒購于南京凱基生物科技發展有限公司。β-actin 抗體和活化的半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）抗體購于美國Cell Signaling Technology 公司。線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）、Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒購于碧云天生物技術研究所。自噬微管相關蛋白輕鏈3（LC3）抗體購于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及給藥將AAVC-I 凍干粉溶于培養基中，配制不同濃度的AAVC-I。將培養的HN4細胞分為4 組：對照組，AAVC-I 低濃度組，AAVC-I中濃度組，AAVC-I 高濃度組。AAVC-I 低、中、高濃度組分別給予2.5、5、10 μg/mL AAVC-I處理，對照組在同一時間給予相等劑量的溶劑（2 mL的培養基）。

1.2.2 HN4 細胞培養將人口腔鱗狀癌HN4 細胞復蘇后接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液中，置于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養，并進行常規傳代，取對數生長期細胞進行相關實驗。

1.2.3 MTT 檢測腫瘤細胞的抑制率MTT 法測定HN4細胞增殖活性，取對數生長期HN4細胞，接種于96孔板。按1.2.1方案分組，每組6個復孔。培養24 h，去上清。每孔加入配制好的MTT 50 μL，在37℃培養箱中孵育4 h，去上清，每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，在酶聯檢測儀上570 nm波長處檢測光密度（OD）值，重復3次。

1.2.4 免疫蛋白印跡法（Western blot）檢測給予AAVC-I 24 h 后，收集細胞用胰酶消化細胞，離心半徑8 cm、1000 r/min，離心5 min，使用細胞裂解液裂解細胞，離心，提取總蛋白。用15%SDS-PAGE 膠電泳分離所提取的蛋白，將蛋白轉到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，將帶有目標蛋白的膜裁好并加入5%脫脂牛奶4℃封閉1 h，然后根據抗體說明書孵育一抗和內參過夜，第2 天用TBST 緩沖液漂洗10 min×3 次，用辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗孵育2 h，再用TBST漂洗10 min×3次，ECL 發光液試劑盒暗室曝光。蛋白水平用UN-SCAN-IT 軟件（Silk Scientific Inc.，Orem，UT，USA）處理分析。

1.2.5 免疫組織化學染色法檢測Caspase-3 的表達量制作細胞爬片。藥物作用24 h 后，取適量0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），處理20 min，3%H2O2室溫放置10 min，吸取液體立即滴加適量山羊血清封閉液，然后在37℃溫箱中封閉30 min。一抗孵育4℃冰箱中過夜，PBS 清洗2 min×3 遍。二抗37℃孵育30 min，PBS 清洗2 min×3 遍后，滴加鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC）試劑，37℃溫育30 min，PBS 清洗2 min×3 遍。最后，二氨基聯苯胺（DAB）顯色及梯度酒精脫水。

1.2.6 JC-1 法檢測線粒體膜電位根據試劑盒說明書，設置陽性對照組，配制JC-1 染色工作液。藥物作用24 h 后，每孔加入1 mL JC-1 染色工作液，充分混勻，在細胞培養箱37℃孵育20 min。然后吸除上清，每孔取適量的JC-1緩沖液（1×）清洗2遍。

1.2.7 免疫熒光法檢測LC3 蛋白的表達量制作細胞爬片。取適量破膜液完全破膜，滴加牛血清白蛋白（BSA）孵育30 min 進行血清封閉，加一抗4℃孵育，加二抗避光孵育50 min。取適量DAPI染液滴加在片子上，避光室溫孵育10 min。洗滌3 次，每次5 min。等片子稍甩干后，用抗熒光淬滅封片劑封片。

1.2.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡給予AAVC-I 24 h 后收集細胞。用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化后離心，收集細胞。先用冷PBS 洗滌細胞，1000×g 離心5 min，棄上清，加入400 μL Annexin V結合液輕輕重懸細胞并進行細胞計數。再加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻2～8 oC 孵育15 min；加入10 μL 碘化丙啶染色液，輕輕混勻2～8oC 孵育5 min。立即上流式細胞儀檢測，重復3次。

1.3 統計學分析采用SPSS 18.0 軟件進行統計學處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 AAVC-I 對HN4 細胞增殖的影響不同濃度的AAVC-I 作用24 h 后，隨著AAVC-I 濃度的增加，AAVC-I 低、中、高濃度組HN4 細胞的增殖抑制率呈上升趨勢。AAVC-I 低、中、高濃度組與對照組比較差異均有統計學意義（P<0.05），但AAVC-I低濃度組與AAVC-I 中濃度組之間差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 Western blot 法檢測Cleaved Caspase-3 的蛋白表達AAVC-I 處 理HN4 細 胞24 h 后，隨 著AAVC-I 濃度增加，Cleaved Caspase-3 表達增加，提示細胞凋亡增加。組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖1，表2。

表1 不同濃度AAVC-I對HN4細胞增殖的抑制作用（±s）

表1 不同濃度AAVC-I對HN4細胞增殖的抑制作用（±s）

與對照組比較，*P<0.05、**P<0.01；與AAVC-I中濃度組比較，#P<0.05

圖1 各組Cleaved Caspase-3的蛋白表達量

表2 Western blot法檢測各組Cleaved Caspase-3的蛋白表達量比較（±s）

表2 Western blot法檢測各組Cleaved Caspase-3的蛋白表達量比較（±s）

與對照組比較，*P<0.05、**P<0.01；與AAVC-I低濃度組比較，#P<0.01；與AAVC-I中濃度組比較，△P<0.05

2.3 免疫組化法檢測Cleaved Caspase-3 的表達不同濃度AAVC-I 處理HN4 細胞24 h 后Cleaved Caspase-3 蛋白表達增加，與對照組比較，隨著AAVC-I 濃度的增加Cleaved Caspase-3 蛋白表達水平上調，組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖2，表3。

表3 不同濃度AAVC-I 處理HN4 細胞后Cleaved Caspase-3蛋白表達量比較（±s）

表3 不同濃度AAVC-I 處理HN4 細胞后Cleaved Caspase-3蛋白表達量比較（±s）

與對照組比較，*P<0.05、**P<0.01；與AAVC-I低濃度組比較，#P<0.01；與AAVC-I中濃度組比較，△P<0.05

圖2 免疫組化法檢測各組Caspase-3的表達（×200）

2.4 JC-1法檢測線粒體膜電位不同濃度AAVC-I作用HN4細胞24 h后，與對照組比較，AAVC-I不同濃度組隨著AAVC-I 濃度的增加，紅色熒光逐漸減少，綠色熒光逐漸增加。各組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05），見表4。

2.5 免疫熒光法檢測LC3 蛋白的表達量不同濃度的AAVC-I 作用24 h 后，隨著AAVC-I 濃度的增加細胞數量逐漸減少，免疫熒光法檢測LC3 蛋白的表達量結果顯示：與對照組比較，AAVC-I 低、中、高濃度組LC3 蛋白的表達量逐漸增加（P<0.05）。見圖3，表5。

2.6 AAVC-I 處理后HN4 細胞的凋亡情況流式細胞儀檢測HN4 細胞凋亡情況顯示，隨著AAVC-I藥物濃度的增加，細胞凋亡率也隨著藥物濃度增加而逐漸增加，并且各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖4，表6。

表4 不同濃度AAVC-I 對HN4 細胞線粒體膜電位的影響（±s）

表4 不同濃度AAVC-I 對HN4 細胞線粒體膜電位的影響（±s）

與對照組比較，*P<0.05、**P<0.01；與AAVC-I 低濃度組比較，#P<0.05、##P<0.01；與AAVC-I中濃度組比較，△P<0.01

表5 不同濃度AAVC-I 處理HN4 細胞后LC3 蛋白的表達量比較（±s）

表5 不同濃度AAVC-I 處理HN4 細胞后LC3 蛋白的表達量比較（±s）

與對照組比較，*P<0.05、**P<0.01；與AAVC-I低濃度組比較，#P<0.01；與AAVC-I中濃度組比較，△P<0.01

圖3 免疫熒光檢測AAVC-I處理后LC3蛋白的表達量（×200）

圖4 不同濃度AAVC-I對HN4細胞凋亡的影響

表6 不同濃度AAVC-I 處理HN4 細胞后細胞凋亡情況（±s）

表6 不同濃度AAVC-I 處理HN4 細胞后細胞凋亡情況（±s）

與對照組比較，*P<0.05、**P<0.01；與AAVC-I低濃度組比較，#P<0.01；與AAVC-I中濃度組比較，△P<0.01

3 討 論

口腔癌狀細胞癌是危害人類健康和生命常見的惡性腫瘤之一，嚴重影響患者的生存質量和精神狀態，據報道全球每年新增患者約10萬人［11］。目前口腔癌的臨床治療手段并不能完全治愈，只能延緩疾病進程，緩解患者癥狀［12］，且中晚期患者的5年生存率依舊很低［13-14］。毒蛇作為一種天然的藥用資源，具有廣泛的生物學活性，其中在抗腫瘤方面具有廣闊的應用前景。大量研究表明，從蛇毒粗度中提取的活性成分除了抗凝、促凝、止痛等功效外，還具備傳統抗腫瘤藥物所具有的功效［15］。而從皖南地區尖吻蝮蛇提取物（AAVC-I）同樣具有抗腫瘤作用，本研究主要探索AAVC-I 在人口腔鱗癌HN4 細胞中誘導腫瘤細胞凋亡的作用以及對自噬的影響。

細胞凋亡是細胞為維持內環境穩定，由基因控制的自主而有序的死亡過程。線粒體調節膜電位并控制細胞程序性死亡，當其受到不良刺激，線粒體內膜與外膜接觸位點處生成通透性轉變孔道，會使線粒體膜通透性提高，引起線粒體跨膜電位不可逆下降，從而導致細胞凋亡［16-17］。線粒體膜通透性增加也能使誘導凋亡因子（AIF）等分子釋放進入細胞質基質，破壞細胞結構。Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）具有促進細胞凋亡的作用。Bax 具有孔形成能力，并能誘導細胞色素C 從線粒體釋放入胞漿［17-18］，在dATP存在時與凋亡蛋白酶激活因子（Apaf-1）結合并激活Caspase-9，后者繼而激活Caspase-3。Caspase-3是Caspase 家族中最重要的凋亡執行者之一，是凋亡途徑下游進行底物酶解的關鍵蛋白酶，被認為是整個凋亡級聯反應的關鍵調節點［19-20］。自噬是依賴溶酶體對大分子蛋白質和某些細胞器進行降解再利用的過程，基礎水平的自噬對細胞具有保護作用，但高水平自噬也有可能過度降解細胞器，促進細胞凋亡［21］。結合相關文獻及本研究結果顯示，AAVC-I可能通過某些途徑上調Caspase-3 蛋白的表達水平，并具有濃度依賴性，JC-1檢測結果表明Caspase-3蛋白的表達水平可能與細胞膜電位的改變有關，同時免疫熒光檢測到LC3 表達增加，表明AAVC-I 可提高HN4 細胞的自噬水平，提示AAVC-I 對口腔鱗癌細胞的促凋亡作用可能是通過降低線粒體膜電位引起Caspase-3的表達增加，并提高自噬水平。

綜上所述，AAVC-I 對HN4 細胞有抑制其增殖、誘導其凋亡作用，這可能是通過降低線粒體膜電位進而上調Caspase-3 蛋白的表達及提高自噬水平實現的。凋亡和自噬兩者的相互關系及轉換機制還需要詳細的研究［22］。本實驗的研究結果可為今后研究口腔鱗癌治療方法提供有利依據，但是細胞的凋亡過程較為復雜，又有多種基因參與細胞的凋亡，因此AAVC-I 在人口腔鱗癌細胞中的凋亡誘導機制還有待進一步的研究。