發光細菌法測定SO2氣體生物毒性的研究

韓麗君 孫玉娟 楊樹平 邢志賢 趙崢 柳蕊

(河北省生態環境監測中心，河北 石家莊 050037)

生物毒性檢測是利用生物監測環境和化學品毒性的技術。發光細菌法環境毒性檢測技術因其靈敏度高、反應速度快、相關性好等原因被廣泛應用在環境監測中，目前主要應用于飲用水[1-3]、污水[4]、土壤和沉積物[5,6]等毒性檢測。盡管生物毒性檢測實驗方法相對簡單，但仍存在很多局限性，如充廢氣的快慢、與菌液接觸時間長短、充廢氣的量等因素都會對實驗結果造成影響，所以發光細菌比較少的運用在大氣污染毒性檢測中[5]。

本次研究以SO2為標準毒性氣體，通過向青?；【鷳腋∫褐型ㄈ氩煌瑵舛鹊腟O2標氣，然后分別測定菌液發光強度，以發光抑制率表征氣體的生物綜合毒性。通過優化實驗條件，建立了系統的氣體生物綜合毒性測試方法。實驗結果表明，可以通過優化曝氣設備的精密性來提高監測的靈敏度和精密度，具有較好的應用前景。

1 材料與方法

1.1 供試材料

青?；【鶴67凍干粉劑(配有復蘇稀釋液和滲透壓調節液)；

發光菌凍干粉復蘇液；

滲透壓調節液；

超純水；

500ppm(20℃、108.8kPa 條件下折算濃度為1429mg/m3)SO2標準氣體，純凈空氣做填充氣；

緩沖溶液。

1.2 實驗儀器

毒性分析儀： ToxScreen-III；

采樣泵(BDQ-3000，量程0.1～3L/min)、曝氣泵(TWA-300T，量程0.02～0.5L/min)；

移液槍：100μL、1mL、2mL；

燒杯：100mL；

測試管：5mL。

1.3 實驗方法和步驟

1.3.1 SO2標氣制備

用Entech4600型動態稀釋儀和純凈空氣將SO2標準氣體稀釋成濃度分別為28.6(10)、57.1(20)、85.7(30)、114.3(40)、142.9 (50)mg/m3(ppm)的SO2系列標氣。

1.3.2 發光菌液復蘇

取1支青?；【鶴67凍干粉置于室溫(20±1°C左右)平衡15min；

取0.5mL復蘇稀釋液加入到平衡后的青?；【鶴67凍干粉試劑瓶中；

溶解后的凍干粉溶液置于室溫下復蘇10min后備用。

1.3.3 曝氣

取2組干凈的5mL測試管，分別加入2mL滲透壓調節液和50μL復蘇菌液，震蕩混勻。立即向其中1組測試管中通入系列濃度的SO2標氣，測定其最終發光值I；同時向另一組測試管中加入0.05mL凍干粉溶液，震蕩混勻，通入等時間、等流量的純凈空氣，測定最終發光值I0，作為空白對照組。

1.3.4 曝氣時間選擇

按照1.3.3方法以114.3mg/m3的SO2為受試氣體依次測定不同曝氣時間梯度的發光菌液發光值，從而選擇合適的曝氣時間。

1.3.5 標準曲線繪制

按照1.3.3方法依次測定曝入系列SO2標氣(1.3.1)的發光菌液發光值，并計算標準曲線的線性回歸方程。

1.3.6 計算發光抑制率公式

E =(I - I/I0)×100%

式中，E為發光抑制率；I為發光強度；I0為空白發光強度對照值。

2 結果與分析

本次實驗的影響因素主要包括實驗溫度、菌液活性、曝氣流量、曝氣時間等。實驗室溫度和菌液活性影響因素已有比較充分的研究[7-9]，實驗過程中要保持室溫20±1℃，且所有測試器皿、試劑及溶液測試前1h均置于控溫的測試室內。本次研究不再做進一步驗證。

2.1 曝氣流量選擇

向待測菌液中通入SO2標氣時，要考慮氣體的流量，防止流速過快從而溢出測試管，還要保證氣體與菌液能充分接觸，有足夠的氧氣供應。實驗表明，曝氣流量越大，發光抑制率越大。由于發光菌液曝氣時會產生泡沫，流量過大會導致菌液溢出而影響實驗結果。因此，本次實驗的曝氣流量選擇菌液不會溢出最大流量0.02L/min。

2.2 曝氣時間優化

向1組配置好的待測菌液中依次通入濃度為114.3mg/L的SO2標氣，曝氣時間分別設置為2、3、4、5、6min，分別測定發光強度并計算相應的發光抑制率E。實驗結果表明，曝氣時間和發光抑制率呈指數上升關系，相關系數R2=0.91，即曝氣時間越長靈敏度越高，詳見圖1。但是，曝氣時間越長空白菌液發光值也越高，增大了實驗誤差，綜合考慮以上2方面因素，以下實驗均將曝氣時間定為5min。

圖1 青海弧菌Q67發光抑制率與SO2曝氣時間關系

2.3 發光抑制率與SO2濃度的效應關系

根據以上優化的實驗條件，在室溫20℃下，向1組配置好的待測菌液中依次通入不同濃度的SO2標氣，SO2標氣濃度分別設置為28.6、57.1、85.7、114.3、142.9mg/m3，曝氣流量設置為0.02L/min，曝氣時間設置為5min，測定發光強度并計算發光抑制率E。實驗結果表明，青?；【鶴67的發光抑制率與SO2標氣濃度呈指數相關，Lg(100E)與SO2標氣濃度線性相關(R2=0.96)，詳見圖2、圖3。

圖2 青?；【鶴67的發光抑制率(E)

圖3 青海弧菌Q67的Lg(100E)與SO2標氣濃度關系

2.4 實驗精密度

本次研究選擇抑制率分別接近90%、50%、10%(實測結果分別為99.6%、54.3%、11.1%)的樣品代表高、中、低抑制率分別進行精密度測試。每個濃度平行測定3次，相對標準偏差分別為5.2%、20.6%、10.3%。高抑制率和低抑制率3次重復測定結果的相對偏差均小于發光細菌在水質中急性毒性測定的最低精密度要求15%[10]，中抑制率樣品測定精密度較低(20.6%)。

與發光菌法測定水質生物綜合毒性相比，氣體毒性實驗增加了曝氣過程，所以誤差較大。氣流量的穩定性和準確性是影響整個實驗準確度的重要因素。實驗裝置的氣密性可通過裝置的改進優化方式解決。

2.5 方法檢出限

由圖2曲線可以計算出發光抑制率為90%、50%、10%所對應的SO2的濃度分別為143mg/m3(全有效濃度界限值)、112mg/m3(半數效濃度)、25.4mg/m3(無效濃度界限值)。當抑制率為10%時，測試的SO2濃度為25.4mg/m3，可做為本實驗的方法檢出限。該檢出限低于國家大氣污染物排放標準(GB13271-2014)中SO2最嚴限值(50mg/m3)。同時，發光菌法毒性測試的LC50(112mg/m3)值也遠低于小鼠毒性值(6600mg/m3)。因此，該方法具有很好的靈敏度和實用價值。

3 結論

實驗結果表明，SO2對青?；【陌l光性有明顯抑制作用，且發光抑制率和SO2濃度有顯著的相關性，可以據此相關性定量測定空氣中SO2的生物毒性；相較于傳統的生物監測用動物(如老鼠)作為受試對象，用發光細菌來測定氣態生物綜合毒性的方法簡單、快速且檢出限低，能夠更好地應用到實際的環境監測當中；與水質生物綜合毒性測試方法相比增加了待測氣體的曝氣過程導致精密度較差，需進一步提高曝氣設備的精密度和自動化水平。