不同磷源在紅霉素工程菌發酵過程中的作用研究

丁彥琴 伍涵宇 牛春 張萍

摘要：通過向紅霉素種子液和發酵培養基中添加磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀，探討2種磷源對紅霉素培養發酵過程中的pH、菌體濃度及效價的影響，以及進一步優化得到最佳的培養基組分配比。結果表明，與原始工藝相比，向紅霉素發酵液中增添適量的磷酸氫二鉀作為無機磷源能增加紅霉素的產量，使發酵搖瓶中紅霉素效價提高了20%，達到7 560 U/mL;采用正交法對發酵液培養基中的淀粉、糊精、磷酸氫二鉀和黃豆餅粉進行了相應的優化，效價升高至7 910 U/mL，較未優化提高4.6%，較未加入磷酸氫二鉀發酵液提高了25.7%。

關鍵詞：紅色糖多孢菌;紅霉素;發酵培養基;磷酸氫二鉀;磷酸二氫鉀

中圖分類號：R978.1+5? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2020）12-0005-03

紅霉素是臨床上被廣泛用于治療革蘭氏陽性菌感染的十四元大環內酯類廣譜抗生素，最早是在1952年從土壤中的紅色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）中分離得到的次級代謝產物，隨后紅色糖多孢菌也成為工業上主要生產紅霉素的放線菌[1]。紅霉素的結構主要由3部分組成，一個十四元的大環即紅霉內酯、紅霉糖和德安糖，彼此通過O-糖苷鍵連接。在紅色糖多孢菌的發酵液中，主要產物是紅霉素A，除此之外還有紅霉素B、紅霉素 C、紅霉素D和少量的紅霉素E、紅霉素F等副產物。其中紅霉素A的抗菌活性最好，紅霉素B的生物活性是紅霉素A的0.15～0.20倍，而毒性則是其毒性的2倍，紅霉素E和紅霉素F的生物活性也只有紅霉素A的0.100～0.125倍[2，3]。以紅霉素A為前體合成的第二、三代紅霉素衍生物己被廣泛應用于臨床，主要用于治療革蘭氏陽性細菌的感染[4]。目前國內生產的紅霉素產量普遍偏低，據有關報道，國外的紅霉素發酵生產水平已達8 000～12 000 U/mL，而國內的發酵水平一般在4 000～5 000 U/mL[5]。因此，對于紅霉素發酵水平效價提高的研究迫在眉睫。

微生物在生長繁殖過程中需要碳源、氮源、磷源、生長因子、無機鹽、水分6大營養物質，其中磷是抗生素發酵培養基中的重要營養來源，對抗生素菌體生長和抗生素的合成有很大的影響。不同種類的磷源對抗生素的產量有密切關系[6]。發酵培養基中磷的來源可以分為有機磷源和無機磷源，有機磷源主要是黃豆餅粉、玉米漿等，無機磷源主要是磷酸鹽的化合物。發酵前期菌絲的生長和發酵單位的增長主要依靠無機磷的作用，而發酵后期促進菌體合成產物主要依靠有機磷的幫助。培養基中增加無機磷的配比可以提高菌體的代謝速度、促進發酵液含固量增長，如磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等。目前紅色糖多孢菌發酵培養過程的培養基主要組成成分是淀粉、黃豆餅粉、糊精和葡萄糖，組分中缺少無機磷源的供給。考慮到磷調控在次級代謝產物合成過程中的作用，本研究通過增加磷源物質磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀，調節兩者的比例，使其達到合適的濃度，保證發酵液中的無機磷源含量，給菌體提供合適的磷源。

1? 材料與方法

1.1? 菌株

紅色糖多孢菌SPH001，寧夏泰瑞制藥股份有限公司實驗室保存的工程菌株。

1.2? 培養基

斜面培養基：淀粉15 g/L，氯化鈉4 g/L，硫酸銨3 g/L，碳酸鈣3 g/L，玉米漿12 g/L，瓊脂粉2.5 g/L，pH 6.95～7.05。

種子培養基：蔗糖35 g/L，硫酸銨4 g/L，玉米漿20 g/L，碳酸鈣5.6 g/L，pH 6.45～6.65。

發酵培養基：淀粉25 g/L，黃豆餅粉30 g/L，糊精35 g/L，硫酸銨0.24 g/L，葡萄糖20 g/L，碳酸鈣5 g/L，豆油8 g/L，pH自然。

1.3? 儀器

高效液相色譜儀，島津企業管理（中國）有限公司;722分光光度計，島津企業管理（中國）有限公司;電子分析天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司;高速離心機，深圳天溯計量檢測股份有限公司;pH計，PHS-25型，上海儀分科學儀器有限公司。

1.4 培養方法

斜面孢子培養：用鏟子刮取原始菌株的孢子，蒸餾水稀釋后，取200 μL均勻涂至茄瓶斜面上，置于溫度33～35 ℃，相對濕度30%～50%培養6～7 d，4 ℃保存使用。

種子培養：取出保存的茄瓶斜面，鏟取1 cm×1 cm大小的斜面孢子接入30 mL的種子培養基中，置于搖瓶機上培養42～43 h，培養溫度為30～33 ℃，相對濕度30%～50%，搖瓶機轉速為220 r/min。

發酵培養：取培養好的種子液1 mL轉入30 mL的發酵培養基中，置于搖瓶機上培養144～168 h，培養溫度為30～33 ℃，相對濕度30%～50%，搖瓶機轉速為220 r/min。

1.5? 分析方法

pH的測定：發酵培養一定周期后，使用pH計對發酵液的pH進行檢測。

菌濃的測定：取10 mL離心管稱管重，再稱取發酵培養液10 g于10 mL的離心管中，5 000 r/min離心10 min，倒掉上清烘干并稱量沉淀的重量，菌體濃度=（沉淀重量-管重）×100%。

化學效價的測定：采用硫酸水解法進行測定，取培養好的發酵液10 mL離心，吸取1 mL上清液至9 mL K2CO3溶液及10 mL乙酸丁酯的比色管中，密塞搖瓶30 s后靜止至分層，吸取5 mL乙酸丁酯相加入至含有10 mL 0.1 mol HCl的分液漏斗中，密塞振搖30 s后靜止至分層，吸取5 mL下層溶液沿管壁加入至含有3 mL濃硫酸的干燥試管中，緩慢晃動試管至顯色后再加力搖勻，放置冷卻至室溫，紫外分光光度計于498 nm處檢測液體的吸光度，根據標準曲線計算溶液的化學效價。

各組分的測定：發酵液離心取上清，加入甲醇5倍稀釋后，5 000 r/min離心10 min，取上清液使用高效液相色譜儀進行檢測。色譜條件為：Waters XBridge^TM C18（250 mm×6 mm，5 μm）色譜柱，流動相為甲醇-乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH 7.00，35∶30∶35），流速為1.0 mL/min，檢測波長為498 nm，柱溫為35 ℃，進樣量為40 μL。根據各組分的峰面積值計算其效價。

2? 結果與分析

2.1? 添加磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀對種子液的影響

種子培養基中分別添加濃度為4、8、10、12、14 g/L的磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀，配方比例見表1，種子液培養42 h后，檢測其pH和菌體濃度，結果如圖1所示，2種磷源濃度在4～14 g/L對種子液的pH不會產生太大影響，但是菌體濃度卻有所改變。當磷酸氫二鉀濃度為4 g/L和8 g/L，菌體濃度明顯升高，表明在種子培養基中加入適當濃度磷酸氫二鉀能促進菌體代謝。

2.2? 添加磷酸氫二鉀和磷酸氫二鉀對發酵液的影響

為了進一步驗證2種磷源對紅霉素工程菌發酵過程的影響，將磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀以4、8、10、12、14 g/L的配比添加在紅霉素發酵培養基中進行單因素試驗考察，配方比例見表2。每種配方做3個平行試驗，對發酵液進行pH、菌體濃度和效價的檢測取平均值，結果見圖2。由圖2可知，發酵液中添加磷酸氫二鉀配比為4 g/L和8 g/L時，能明顯提高菌體濃度，搖瓶效價亦從6 293 U/mL升高至7 560 U/mL。而添加磷酸二氫鉀為4 g/L時發酵液菌體濃度和效價沒有明顯改變，為8 g/L時菌體濃度和效價開始下降。當繼續增大2種磷源濃度時，菌體濃度逐漸呈現下降趨勢，效價也隨之下降。由于無機磷能增加菌體代謝速度，促進菌體生長，使得添加少量的無機磷源發酵單位也隨之增長。但是磷源過高會使氮磷比例失衡，打破菌體的代謝平衡，導致菌體代謝緩慢，發酵單位也隨之下降。磷酸二氫鉀溶解使發酵液呈酸性，而酸性條件不利于紅霉素菌體的代謝生長，故使得搖瓶發酵產生紅霉素的量愈來愈低。

2.3? 含磷源培養基配比的確定

根據單因素試驗對培養基中添加磷源所進行的研究，最終確定在發酵液培養基中添加4～8 g/L的磷酸氫二鉀。進一步考察淀粉、黃豆餅粉、糊精和磷酸氫二鉀的最優配比。得到一個合適的發酵液培養基配方，各因素水平見表3。采用L9（34）進行正交試驗，確定最優培養基配比，結果見表4。由表4可知，馬鈴薯淀粉、黃豆餅粉、糊精和磷酸氫二鉀4種因素對發酵水平的影響程度排序為A>D>B>C，其中最優的培養基搭配方式為A3B3C2D1，即淀粉30 g/L、黃豆餅粉30 g/L、糊精30 g/L、磷酸氫二鉀8 g/L。

3? 討論

本試驗探討了2種無機磷源（磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀）對紅色糖多孢菌培養過程產生紅霉素的影響，發現添加適當濃度磷酸氫二鉀對紅色糖多孢菌的生長可產生促進作用，當磷酸氫二鉀濃度為8 g/L，種子液和發酵液中菌體濃度都會明顯升高，效價也相應提高至7 560 U/mL，當濃度不斷增大至10、12、14 g/L時，菌種的生長受到抑制，代謝減弱，菌體濃度下降，效價降低。由此可知，培養基中添加適當濃度磷酸氫二鉀在紅霉素的發酵過程中發揮著重要的作用。

為了使培養基中碳源、氮源和磷源的搭配達到一個合適的配比，本試驗進一步采用正交法對發酵液的培養基進行了相應的優化。結果表明，淀粉、糊精和黃豆餅粉對紅霉素的效價有顯著性影響[7]，淀粉和糊精作為速效碳源，易被菌體利用，促進菌體的生長代謝[8]，黃豆餅粉是抗生素發酵工業中主要的有機氮源，特別是在紅霉素發酵過程中扮演著十分重要的角色[9]，在發酵前期，黃豆餅粉可以作為菌體生長所需的碳骨架[10]，在發酵中后期，它可以提供菌體所需的氨基酸。因此，在發酵液培養基組成中，重點優化了淀粉、黃豆餅粉、糊精以及磷酸氫二鉀4種發酵液組分，結果表明，淀粉對紅霉素效價的影響最大，其次是糊精、磷酸氫二鉀和黃豆餅粉，當4種組分的搭配比例分別為30、30、30、8 g/L時效價提高至7 910 U/mL，較未優化時提高4.6%。

綜上所述，8 g/L的磷酸氫二鉀能提高紅色糖多孢菌產紅霉素的效價，同時在發酵液的主要影響組分達到合適配比的情況下，效價亦得到提高，為進一步研究紅霉素培養基組成優化奠定了基礎。

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