糜子葉片表皮蠟質的組分及晶體結構分析

李 芮，劉曉宇，劉 樂，隗正陽，賈亞濤，關露露，吳洪啟，李春蓮，汪 勇，王中華

(西北農林科技大學農學院/旱區作物逆境生物學重點實驗室, 陜西 楊凌 712100)

植物表皮蠟質即植物積累在植物細胞壁外側的脂溶性結構，其廣泛存在于植物與空氣直接接觸的表面，并在植物表面形成一道天然薄膜，具有保護植物免受物理損傷、病蟲害入侵、紫外線灼傷等作用，同時也防止植物非氣孔性水分散失、提高植物光合效率[1-5]。因此探究植物表皮蠟質的組成變化對了解植物抗逆性具有重要意義。在植物生長發育過程中，蠟質的含量、組分和晶體結構與環境條件密切相關，干旱及陽光充足的情況下蠟質含量會顯著增加，同時也會造成蠟質晶體結構的改變[6]。表皮蠟質晶體結構也會因不同植物或同種植物不同器官而存在不同的形狀，如片狀、圓柱狀、管狀等[7-9]。蠟質組成中含有大量的伯醇和萜類化合物，會呈現片狀的晶體結構，而含有大量的二酮、仲醇和二醇等化合物則會呈現柱狀晶體[6]。植物表皮蠟質通常由多種化合物組成，已有研究證實，脂肪醇、烷烴、醛、酮、酯、脂肪酸、萜類、酚類、固醇等化合物在水稻、小麥、玉米、高粱等作物中普遍存在[10-13]。

糜子(PanicummiliaceumL.)在我國干旱半干旱地區廣泛種植，同時也是重要的糧食作物，其葉片上、下表面均有較厚的角質膜且分布有大量蠟質，氣孔分布于葉表面且下陷[14]。糜子的生理代謝、生長發育、產量及品質均受干旱的影響。目前關于糜子抗旱方面的研究多集中于糜子對干旱逆境的生理生態響應[15]、抗旱遺傳資源[16-17]及抗旱基因[18]等方面，而有關糜子表皮蠟質的研究鮮有報道。糜子、水稻等作物不同的器官表皮蠟質性狀也影響著作物的抗旱性。因此，研究糜子表皮蠟質組成及晶體結構，將為糜子抗旱性研究和品種選育提供一條新的思路和途徑。本研究選取5種糜子品種作為試驗材料，采用氣相色譜-質譜聯用儀對不同品種及不同時期糜子葉片表皮蠟質組成成分、含量進行測定與分析，并利用掃描電子顯微鏡觀察葉片表皮蠟質的晶體結構，以了解糜子蠟質的組成及晶體形態，為進一步探究糜子蠟質組成與抗旱性的關系及其蠟質合成途徑的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為普通糜子品種榆黍1號、雁黍7號、隴糜8號、晉黍9號和寧糜10號，種植于西北農林科技大學科研試驗田。為了檢測不同品種糜子葉片表皮蠟質含量，分別提取開花期的榆黍1號、雁黍7號、隴糜8號、晉黍9號和寧糜10號旗葉葉片表皮蠟質進行氣相色譜分析，并利用掃描電子顯微鏡觀察不同品種糜子旗葉葉片的晶體結構。為了分析不同生長發育時期糜子葉片表皮蠟質含量的變化情況，取榆黍1號在出苗生長15 d(三葉期)、20 d、25 d、30 d、35 d(開花期)和40 d(灌漿期)的植株上部發育完好的葉片，分別提取表皮蠟質并進行氣相色譜分析。所有進行氣相色譜分析的樣品均取4個生物學重復。

1.2 糜子葉片表皮蠟質的提取

將糜子樣品小心剪成小段置于50 mL燒杯中，在通風櫥內向燒杯中倒入氯仿直至將樣品完全浸沒。鑷子輕翻葉片后將葉片取出，以保證蠟質完全溶解。在燒杯中用玻璃注射器加入10 μL濃度為1 mg·mL-1的C24烷烴作為內標，放置于通風櫥中以使氯仿自然揮發。待氯仿揮發至10 ml左右，用玻璃漏斗將其過濾至15 mL樣品瓶中，同時使用氯仿漂洗燒杯3次，并將漂洗液全部過濾至樣品瓶。將其置于通風櫥中自然揮發，待揮發至1 mL時用膠頭滴管轉入GC樣品瓶中，同時漂洗過濾液樣品瓶并全部轉入GC樣品瓶。在通風櫥中使用氮氣恒溫吹干儀將樣品吹干后，用玻璃注射器加入30 μL吡啶和30 μL雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，立刻蓋好瓶蓋。在70℃反應50 min后使用氮氣將反應液吹干，再加入1 mL氯仿回溶，以供GC-MS分析。

1.3 蠟質成分色譜分析

對于蠟質組成成分的檢測與分析使用氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS-QP2010，日本島津)。將檢測出的離子峰通過質譜數據庫進行搜索和比對，對蠟質各組分進行定性分析并得到標準樣品圖。利用Lab Solution軟件對蠟質各組分離子峰進行積分，計算峰面積，根據C24內標的含量定量分析蠟質各組分化合物。同時糜子葉片樣品采用掃描儀進行葉片表面掃描，并用Image J軟件計算表面積。蠟質含量的計算公式為：表皮蠟質絕對含量=各蠟質組分化合物離子峰面積/內標離子峰面積×內標加入量/樣品表面積；蠟質相對含量=蠟質絕對含量/蠟質總含量×100%。

1.4 掃描電子顯微鏡觀察

選取表面未被破壞且平整的不同品種糜子葉片，用鑷子輕放于白紙上并用回形針固定。將固定好的葉片放置于烘箱中干燥，待水分完全散失后進行掃描電子顯微鏡觀察并拍照。掃描電子顯微鏡使用方法：在掃描電子顯微鏡樣品盤上粘貼適量導電膠，將水分完全散失的葉片樣品取出，刀片切取2 mm×2 mm樣品并粘貼至導電膠上。將樣品盤抽真空并噴金鍍膜，即可進行掃描觀察。

2 結果與分析

2.1 糜子葉片表皮蠟質組成成分分析

由圖1可見，氣相色譜離子峰圖顯示不同離子峰均獨立分布，表明糜子葉片表皮蠟質中各類化合物均被很好分離，而且不同品種間葉片表皮蠟質組成比較相似。經質譜數據庫檢索，共鑒別出20種化合物，主要分為烷烴、初級醇和萜類。其中，烷烴類化合物有11種，碳鏈長度為C25-C35；初級醇類化合物有7種，均為偶數碳原子(C22-C34)；萜類物質有2種，分別為β-Amyrin和α-Amyrin。

注：1：內參；2：C25烷烴；3：C22醇；4：C26烷烴；5：C27烷烴；6：C24醇；7：C28烷烴；8：C29烷烴；9：C26醇；10：C30烷烴；11：C31烷烴；12：C28醇；13：C32烷烴；14：C33烷烴；15：β-Amyrin；16：α-Amyrin；17：C34烷烴；18：C35烷烴；19：C32醇；20：C34醇。Note: 1: Internal standard; 2: C25H52; 3: Docosanol; 4:C26H54; 5: C27H56; 6: Tetracosanol; 7: C28H58; 8: C29H60; 9: Hexacosanol; 10: C30H62; 11: C31H64; 12: Octacosanol; 13: C32H66; 14:C33H68; 15: β-Amyrin; 16: α-Amyrin; 17:C34H70; 18: C35H72; 19: Dotriacontanol; 20: Tetratriacontanol.

2.2 糜子葉片表皮蠟質各組分含量分析

通過定量分析發現，初級醇含量在各糜子品種葉片表皮蠟質的各組分含量中占比最高，其次是烷烴，并含有少量的萜類(表1)。品種間葉片總蠟質含量存在明顯差異，其中榆黍1號蠟質總含量最高，為25.87 μg·cm-2，寧糜10號蠟質總含量最低，為17.99 μg·cm-2(表1)。初級醇含量也有顯著差異，其中榆黍1號初級醇含量顯著高于其他各品種。初級醇平均約占蠟質總量的67.46%，其中隴糜8號最低為65.41%，榆黍1號最高為71.09%；烷烴平均約占總量的29.01%，其中榆黍1號最低為26.05%，隴糜8號最高為31.03%。

對初級醇不同長度碳鏈化合物分析表明，C32醇含量最高，約占初級醇總量的82.73%；其次是C30和C34醇，分別占總量的7.70%和6.18%。此外，C28醇含量較低，占總量的1.83%，而C22醇、C24和C26醇含量極低，均小于1%(圖2)。對烷烴不同長度碳鏈化合物分析表明，C33烷烴含量最高，約占烷烴總量的36.92%；其次是C31烷烴和C34烷烴，分別占總量的30.49%和18.17%。而C27、C29、C30、C32、C35烷烴含量相對較少，約小于5%。此外，糜子葉片表皮蠟質中C25、C26和C28烷烴含量極低，均小于1%(圖3)。

注：不同字母代表同一物質不同品種間差異，小寫字母表示在P<0.05水平顯著差異，大寫字母表示在P<0.01水平顯著差異。下同。Note：Different letters in the same substance represent different varieties, lowercase letters mean significant difference at P<0.05 level，uppercase letters mean significant difference at P<0.01 leveL. The same below.

圖3 糜子生長發育35 d葉片中不同鏈長烷烴的絕對含量

2.3 不同糜子品種旗葉葉片表皮蠟質晶體結構觀察

掃描電鏡觀察結果表明，糜子旗葉葉片表面覆蓋有大量的蠟質晶體，晶體類型主要呈片狀。葉片上、下表面的蠟質晶體密集度具有明顯的差異，呈片狀的蠟質晶體緊密而均勻地分布于整個葉片的上表面，葉片下表面的片狀蠟質晶體很少，整個表面相對比較平滑。不同糜子品種間葉片表皮蠟質晶體密集程度存在顯著差異，其中榆黍1號和晉黍9號葉片上表面蠟質晶體分布最為緊密，寧糜10號則相對稀疏。并且榆黍1號葉片下表面含有少量顆粒狀蠟質晶體而其他品種則相對比較平滑(圖4)。

注: A和B: 晉黍9號葉片; C和D: 隴糜8號葉片; E和F: 寧糜10號葉片; G和H: 雁黍7號葉片; I和J: 榆黍1號葉片。Note: A and B:Leaves of Jinshu 9; C and D: Leaves of Longmi 8; E and F: Leaves of Ningmi 10; G and H: Leaves of Yanshu 7; I and J: Leaves of Yushu 1.

2.4 糜子不同生長發育時期葉片表皮蠟質組分分析

以榆黍1號為例，從表2可知，糜子葉片不同生長發育時期蠟質組成比較相似，均含有初級醇、烷烴及萜類物質；并且各發育時期均以初級醇含量最高，其次為烷烴含量，而萜類物質含量最低(表2)。不同的是，各發育時期糜子葉片總蠟質含量以及各組分含量均有顯著差異。在生長發育15 d時，由于糜子處于生長發育初期階段，蠟質合成活動進行得緩慢，造成蠟質總量積累較少。隨著糜子的生長發育，蠟質合成活動逐漸活躍，葉片蠟質不斷積累，在20、25、30、35 d和40 d時的蠟質總含量分別是15 d時的1.5、1.7、1.9、2.4和2.6倍(表2)。各蠟質組分含量總體也表現出隨著糜子的生長發育而不斷增加的趨勢。其中初級醇的含量在發育15～25 d期間穩定升高，在25 d時達到13.79 μg·cm-2，占總蠟質含量的74.46%；25～30 d期間稍有降低，在30天時降至12.95 μg·cm-2，占總含量的64.91%；30～35 d期間出現初級醇絕對含量快速增加的過程，在35 d含量最高為18.39 μg·cm-2，占總含量的71.09%；而在發育后期即35 d之后逐漸降低(表2)。烷烴含量的變化也表現出相似的模式，在發育15～20 d期間，烷烴含量穩定升高，在20 d時達到5.71 μg·cm-2，占總含量的36.60%；在20～25 d期間稍有降低，25 d時降至4.06 μg·cm-2，占總含量的21.92%；而在25 d之后穩定增加，烷烴絕對含量快速增加過程出現在35～40 d，在40 d時含量最高為11.31 μg·cm-2，占總蠟質含量的40.52%(表2)。萜類物質絕對含量同蠟質總量變化相同，即隨著生長發育不斷增加，在40 d時含量最高，為0.77 μg·cm-2(表2)，但相對含量隨生長發育不斷降低。

表2 榆黍1號不同時期葉片表皮各組分含量/(μg·cm-2±SD)

3 討論與結論

本研究結果表明，糜子葉片的表皮蠟質主要由20種有機化合物組成，包括11種烷烴、7種初級醇、以及2種三萜類物質。所選用材料為黃土高原區種植的普通糜子品種榆黍1號、雁黍7號、隴糜8號、晉黍9號和寧糜10號，不同品種糜子間蠟質成分及各化合物所占比例比較相似，說明糜子葉片表皮蠟質組成成分在不同糜子品種間是相對穩定的。但不同品種的蠟質總含量卻存在著明顯的差異，使這些品種呈現出高蠟和低蠟的特征，比如高蠟品種榆黍1號蠟質總含量是低蠟品種寧糜10號的1.4倍。

在禾本科主要糧食作物中，玉米葉片蠟質成分為烷烴、醇、醛、酯類和脂肪酸，其中醇、脂肪酸和酯為最主要成分，蠟質組分的碳鏈分布主要集中在C25-C48[11]；小麥葉片蠟質中初級醇、烷烴和二酮為主要成分，蠟質組分的碳鏈分布主要集中在C25-C31[9,12]；高粱葉片蠟質成分為醛、烷烴、初級醇、脂肪酸和酮類物質[13]。而本研究表明，糜子不同品種及不同生長發育時期葉片表皮蠟質均以初級脂肪醇為主，C32醇含量最高；其次是烷烴，C33及C31烷烴含量相對較高；萜類含量最低。這與水稻、玉米及高粱等作物的蠟質組成有一定的差別，暗示糜子蠟質合成與調控途徑與水稻、玉米及高粱等作物不同[19-22]。糜子蠟質組成相對簡單，初級醇和烷烴是其主要的蠟質成分，約占總蠟質含量的95%以上(表1)，說明糜子蠟質的生物合成主要集中在初級醇和烷烴的合成，具體的合成機制值得進一步討論和探究。

觀察掃描電子顯微鏡的結果，我們發現不同糜子品種旗葉葉片的上、下表面蠟質晶體的疏密及結構均有顯著差異，上表面呈比較密集的片狀，下表面呈稀疏的顆粒狀或平滑表面。不同糜子品種之間蠟質晶體疏密程度有明顯的差別，榆黍1號和晉黍9號葉片表皮蠟質分布最為緊密，寧糜10號則相對稀疏。同時，Barthlott等[23]研究證明，蠟質組成中含有大量的伯醇和萜類化合物會呈現片狀的晶體結構，而含有大量的二酮、仲醇和二醇等化合物則會呈現柱狀晶體。本研究發現，糜子葉片表面的蠟質呈片狀結構，這與葉片蠟質成分中初級醇的含量最高相對應。

環境的變化很大程度影響著植物表皮蠟質的合成及蠟質的晶體結構。植物表皮蠟質含量在受環境脅迫如干旱等條件下會顯著增多，且蠟質晶體分布更為密集[24]。本研究中，糜子不同品種及不同發育時期葉片表皮均覆蓋有豐富的蠟質并且在葉片表面形成片狀晶體結構，說明這些蠟質對于糜子應對干旱等逆境脅迫起著重要的作用。

不同生長發育時期糜子葉片表皮蠟質含量也存在差異，糜子從三葉期(15 d)到灌漿期(40 d)葉片表皮蠟質含量逐漸增加(表2)。其他作物中也有相似的研究結果，如汪勇等[12]研究發現，在小麥葉片發育早期，初級醇的含量最高，發育中后期，烷烴和二酮含量快速增加，總蠟質含量從苗期到開花灌漿期呈現持續增加的趨勢。王聰等[25]研究發現，大麥葉片蠟質也隨生長發育進程而呈現逐漸增加的趨勢。前人的研究表明，糜子葉片的凈光合速率、氣孔導度、水分的蒸騰速率等會因為其在苗期、拔節期和孕穗期受到干旱脅迫而較大程度地降低，但在灌漿期，蒸騰速率、氣孔導度等的降低幅度明顯減小，并且凈光合速率基本不變[26-27]。本研究中檢測到的葉片表皮蠟質逐漸增加的現象與這些光合生理檢測結果有很好的對應性，可能就是糜子在生長發育過程中對干旱脅迫做出的適應性反應以及產生的生理效應，這些生理指標與蠟質合成的關系值得進行更深入的研究，這對于提高糜子的抗旱性進而提高糜子的產量具有重要的研究價值。

本研究表明，不同糜子品種葉片表皮蠟質含量有顯著差異，但不同糜子品種蠟質組成成分相同，均以碳鏈長度分布范圍為C22-C35的烷烴、初級醇、萜類物質等20種化合物為主。初級醇是糜子葉片表皮蠟質的主要組成成分，其中C32醇含量最高。同時，糜子不同生長發育時期蠟質組分含量也有顯著差異，即蠟質總量隨生長發育時間不斷增加，但蠟質組成相同，以初級醇為主。掃描電鏡觀察表明，葉片表皮蠟質晶體結構為片狀和少量球狀，并且蠟質晶體結構的密集程度與葉片表皮蠟質含量多少相對應。本研究首次對糜子葉片蠟質的發育進行了研究，分析了糜子不同生長發育時期的蠟質成分變化，為今后研究糜子蠟質組分的合成機理奠定了基礎。