基質分散固相萃取-QuEChERS耦合HPLC法測定棉花葉片中吡蟲啉及其相關代謝物

節夢蕾，時英爽，高有華，韓 瑤，袁 震，景偉文

(1.新疆農業大學化學工程學院, 新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農業大學農學院, 新疆 烏魯木齊 830052)

棉花是我國重要的經濟作物之一，新疆是我國棉花的主產區。棉花的種植過程中每年都要大量使用吡蟲啉農藥來防治蟲害[1]。吡蟲啉(1-(6-氯-3-吡啶甲基)-N-硝基咪唑-2-亞胺，imidacloprid，IMI)是新煙堿類殺蟲劑的第1個成員。該殺蟲劑通過破壞昆蟲中樞神經系統中的煙堿乙酰膽堿受體起作用，應用較為廣泛[2-4]。吡蟲啉屬于內吸性農藥，當用于農作物時，殺蟲劑到達植物的內部并轉化為多種代謝物。吡蟲啉降解產生的幾種代謝物中，一些具有生物活性的代謝物在很大程度上被植物保留。這些代謝物因其比農藥母體具有更強的生態毒性和環境穩定性，對環境和人類健康的危害甚至遠高于農藥母體[5-7]。因此，研究棉花葉片中吡蟲啉及其代謝物對科學合理使用農藥、提高農產品品質以及全面評價其環境影響都有著重要的意義。目前大多數分析研究主要集中在母體化合物上，有關其代謝物的研究非常有限[8-9]。

吡蟲啉在不同介質中的代謝途徑主要通過以下4種方式來進行：(1)經反硝化作用直接產生吡蟲啉胍，然后進一步氧化為吡蟲啉脲；(2)吡蟲啉中的硝基被還原成為亞硝基衍生物，亞硝基進一步被還原成為吡蟲啉胍；(3)咪唑環被氧化形成4,5-二羥基吡蟲啉，然后脫水形成烯式吡蟲啉；(4)再經水解形成6-氯煙酸(6-CNA)，并與介質中共存的小分子(氨基酸，麥芽糖，葡萄糖，丁二酸等)形成不同的結合物 。

建立吡蟲啉及其代謝物含量的測定方法是進行相關研究的前提條件。農藥測定的主要步驟包括樣品預處理和儀器分析[10-11]。QuEChERS前處理方法由美國農業部Anastassiadas M等[11]于2003年提出，是當前在農藥殘留提取上使用最為普遍的前處理技術之一，得名于其快捷、簡易、廉價、有效、可信、安全的特征。由于方法本身具有模板的性質，為適應不同基質和分析物的測定要求，需不斷進行嘗試和改進。而與葉類蔬菜食品相比，作物葉片中富含大量的酚類、酯類和色素類物質，因此基于測定基質的不同特點，要求前處理方法有一定的適應性，但目前大量的研究結果集中在食品方面[12-14]。另外，目前主要采用高效液相色譜質譜聯用技術(HPLC-MS)對吡蟲啉代謝產物進行測定。王建華等[15]利用HPLC-MS/MS技術建立的分析方法回收率為71.9%～117.8%，相對標準偏差(RSD)為0.8%～9.6%，定量限(LOQ)為0.2～1.0 μg·kg-1。Polat等[16]利用LC-MS/MS技術建立的分析方法回收率為107.12%，RSD為17.96%。Xu等[17]利用UPLC-MS/MS技術建立的分析方法回收率為60.5%～114.6%，RSD<20%，LOQ為0.1～17.3 μg·kg-1。Seo等[18]利用HPLC-MS技術建立的分析方法RSD≤20%，回收率為70%～120%，檢出限(LOD)達到5～10 μg·g-1。雖然上述研究所建立的分析方法完全滿足測定要求，但是LC-MS技術儀器投資成本高，操作也比較復雜，目前還未得到廣泛運用。HPLC因具有成本低、靈敏度高、基體效應小等優點[19]，仍然是運用最為廣泛的農藥殘留檢測方法。因此，建立吡蟲啉和代謝物同時測定的色譜方法，不失為現行條件下經濟、快速、全面檢測農藥殘留的不二選擇。但目前可以借鑒的研究并不多。本研究采用QuEChERS方法耦合HPLC方法測定棉花葉片中的吡蟲啉和代謝物，針對測定基質的不同特點對QuEChERS前處理方法中的相關影響因素逐一進行了詳細討論，并探索出適當的HPLC測定條件，最后運用該方法對樣品中吡蟲啉及其4種代謝物6-氯煙酸、吡蟲啉胍、烯式吡蟲啉和吡蟲啉脲的殘留情況進行了定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑以及溶液的配制

儀器和試劑：LC-20AB高效液相色譜儀(島津公司，日本)；吡蟲啉標準品(100 μg·mL-1，純度>97%)購自北京壇墨質檢科技有限公司。6-氯煙酸標準品(純度>99%)購自上海阿拉丁試劑有限公司。烯式吡蟲啉(純度>98.7%)、吡蟲啉脲(純度>99.7%)和吡蟲啉胍標準品(純度>83.9%)均購自德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。QuEChERS方法所用試劑均購自深圳逗點生物技術有限公司。

標準儲備液：以流動相溶解后定容，配制成質量濃度分別為10.00、510.00、400.00、570.00 mg·L-1和520.00 mg·L-1的吡蟲啉、吡蟲啉脲、烯式吡蟲啉、吡蟲啉胍、6-氯煙酸單標儲備液。而后分別準確移取適量上述單標儲備液稀釋成所需濃度。溶液4℃避光保存。

1.2 大田施藥方法和樣品材料準備

在新疆烏魯木齊三坪農場按制劑量47.25 g·hm-2于2018年8月手動噴霧葉面施用吡蟲啉粉劑(70%水分散粒劑)。另設清水空白對照，處理間設保護帶。小區面積為15 m2,各處理設4個重復，藥后定時采樣。隨機采集棉花葉片1 kg帶回實驗室內貯于低溫冰箱中保存待用。

1.3 測定方法

1.3.1 樣品的前處理方法 稱取10.00 g打碎后的棉花葉片于50 mL離心管中，加入20.00 mL乙腈，振蕩5 min后加入鹽析材料，搖勻，振蕩5 min后超聲3 min，于4 000 r·min-1下離心5 min，取2.00 mL上清液快速加入帶有凈化劑的離心管中，快速手動振搖后將上清液以0.22 μm有機相微孔濾膜過濾，待測。

1.3.2 色譜檢測條件 取20 μL濾液HPLC進樣檢測，記錄峰面積。儀器：SPD-20紫外檢測器；色譜柱：ODS-3(4.6 mm×250 mm, i.d., 5 μm)，測定波長：270 nm；洗脫方式：等度洗脫；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

1.3.3 方法的驗證和應用 每個樣品平行測定3次，結果取其平均值，方法驗證和樣品測定具體見文章2.5和2.6小節。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

HPLC中流動相種類會直接影響目標物檢測的選擇性、靈敏度和分離效果[20]。由于代謝物在結構和極性上相似性較高，因此給分離測定帶來一定困難。考察不同流動相的分離結果，發現當采用2%乙腈/甲醇-水作為流動相時，能夠得到較好的峰形和較高的分離度且雜質干擾較少，檢測效果較好。因此，確定流動相為2%乙腈/甲醇-水，比例3∶7，流速0.7 mL·min-1(參看圖4)。

2.2 提取溶劑的選擇

提取劑的選擇對試驗的檢測結果有著直接影響。乙腈是適宜范圍較寬的常用萃取劑，并且對于含色素較多的樣品也顯示出理想的提取效果[21]。考慮到提取溶劑pH值對棉花葉片中農藥回收率的影響，本文采用乙腈和5%甲酸-乙腈進行對比試驗，按上述的分析方法和液相色譜條件對樣品進行分析測定。如圖1所示，當以乙腈作為提取劑時，所得的吡蟲啉及其4種代謝物的回收率較高，并且其相對標準偏差較小，提取效果良好。本實驗最終選擇乙腈作為提取溶劑。

圖1 乙腈和5%甲酸-乙腈的提取效果比較

2.3 鹽析材料的選擇

QuEChERS前處理方法的鹽析材料有兩種，第一種是EN方法推薦的無水MgSO4、Na3C6H5O7和C6H6Na2O7，另一種是AOAC方法推薦的無水MgSO4和無水C2H3NaO2[22-23]。在樣品提取液中分別添加這兩種萃取鹽析材料(鹽析試劑A：6.00 g MgSO4，1.00 g NaCl，1.50 g C2H3NaO2；B：4.00 g MgSO4，1.00 g NaCl，1.00 g Na3C6H5O7，0.50 g C6H6Na2O7)，結合使用凈化材料進行前處理，其他步驟同1.3.1，以回收率考察萃取效果。所得鹽析試劑A組合對吡蟲啉及其代謝物的回收率為5.00%～108.44%，RSD為0.03%～15.33%。鹽析試劑B組合的回收率為54.50%～108.30%，RSD為0.07%～2.08%，其結果偏差小，更穩定，效果好于A。故1.00 g氯化鈉、4.00 g無水硫酸鎂、0.50 g檸檬酸二鈉鹽和1.00 g檸檬酸鈉為選用的鹽析材料。

2.4 凈化劑的選擇及用量

PSA(N-丙基乙二胺)、C18和GCB(石墨化碳黑)為QuEChERS前處理方法中常用的固相萃取吸附劑。在離心管中依次將C18、PSA、C18+PSA、C18+PSA+GCB這4種組合的凈化材料分散加入到樣品的萃取液中吸附干擾物，其他前處理步驟不變，同樣以回收率檢驗凈化效果，結果如圖2所示。由圖2可知，綜合所有代謝物的回收率來看，PSA能有效地吸附雜質而不影響目標物的測定。同時結合圖4發現，PSA能夠消除吡蟲啉及其代謝物目標峰周圍干擾雜質的影響。因此，PSA作為本次試驗的凈化材料最為適宜。

圖2 凈化劑的種類對回收率的影響(用量均為50 mg)

吸附劑用量也會對雜質凈化產生影響，用量過少，基質去除不完全；用量過多，則分散劑會吸附分析物，影響到回收率，因此需對PSA的使用量進行篩選。分別取10、20、25、30、40、50 mg PSA于離心管中，各加入棉花葉片樣品提取液，其余預處理步驟不變，結果如圖3所示。由圖3可知，當PSA的用量為25 mg時，能得到較好的回收率，效果最佳，因此將25 mg選為適宜用量。

圖3 PSA的用量對回收率的影響

2.5 方法學的驗證

取10.00 g空白棉花葉片樣品，加入不同濃度吡蟲啉的混標溶液，采用乙腈作為提取液，試劑A組合作為鹽析材料，25 mg PSA作為凈化劑，進行加標回收試驗。我國NY/T 788—2004《農藥殘留試驗準則》[24]對于檢測分析方法的要求是：當添加濃度大于0.01 mg·kg-1時，其合適的回收率應在70.00%～120.00%，相對標準偏差(RSD)應小于10.00%。由表1可知，在不同添加水平下，6-氯煙酸、吡蟲啉胍、烯式吡蟲啉、吡蟲啉脲和吡蟲啉的回收率分別為96.47%～109.32%、96.80%～110.90%、92.84%～107.61%、93.86%～105.98%和98.15%～107.73%，RSD分別為0.15%～1.17%、0.72%～1.31%、3.75%～6.99%、0.79%～5.03%和3.21%～5.92%。各指標的具體測定結果見表2。6-氯煙酸、吡蟲啉胍、烯式吡蟲啉、吡蟲啉脲和吡蟲啉的LOD分別為0.0066、0.091、0.0011、0.042 mg·kg-1和0.0044 mg·kg-1，LOQ分別為0.028、0.036、0.0059、0.19 mg·kg-1和0.015 mg·kg-1，相關系數在0.9988～0.9998之間。由此表明，該方法能夠滿足定量分析的基本要求。

表1 樣品的加標回收率和相對標準偏差

表2 吡蟲啉及其代謝物的檢出限、定量限、線性范圍和線性方程

2.6 實際樣品的測定

以上述建立的方法對樣品進行測定(詳例如圖4)。測定結果顯示，噴藥后0～7 d，代謝物在棉花葉片中均未檢出，吡蟲啉的含量為0.53～1.99 mg·kg-1。第10天檢出6-氯煙酸，10～15 d的吡蟲啉及代謝物6-氯煙酸、吡蟲啉胍、烯式吡蟲啉、吡蟲啉脲的含量分別為0.20～0.23、0.79～2.16、0.09、0.06 mg·kg-1和0.28 mg·kg-1，此時吡蟲啉已不是主要的殘留物。

注：Ⅰ～Ⅴ依次代表6-氯煙酸，吡蟲啉胍，烯式吡蟲啉，吡蟲啉脲，吡蟲啉。Note:Ⅰ～Ⅴ: mean 6-chloronicotinic acid, guanidine-imidacloprid, olefin imidacloprid, imidacloprid urea, imidacloprid, respectively.

3 討 論

QuEChERS前處理方法采用凈化劑的目的是盡量使吡蟲啉與樣品基質分離，從而減少樣品中其他組分對目標物的干擾，采用不同凈化材料的效果不同。GCB可有效去除基質中色素[25]，也對某些農藥有一定吸附作用[26]，使用GCB作為凈化吸附劑時，吡蟲啉脲被GCB吸附，導致回收率小于20%。N-丙基乙二胺(PSA)屬于固相吸附劑，能夠與金屬離子反應形成鰲合物以及與羥基形成共價鍵氫鍵，主要用于去除糖類、酚類、有機酸，尤其對于有機酸和極性化合物的親和性比較好，同時對大部分農藥吸附能力較弱，因而作為固相萃取物被廣泛地用作農藥殘留檢測的凈化劑。棉花葉片基質中的主要干擾物為有機酸、多酚、碳水化合物和甾醇等，PSA作為弱陰離子交換吸附劑，通過對上述干擾物進行吸附能夠達到較好的凈化效果，但PSA對目標物也有一定的吸附作用。確定合適的PSA用量不但能提高吡蟲啉及其4種代謝物的凈化效果，同時能減少凈化劑對棉花葉片樣品中檢測目標物的損耗，保證回收率。在提取液中加入C18吸附劑能夠吸附去除棉花葉片中較少的脂肪類物質，進一步提高對吡蟲啉的凈化效果。但是C18對代謝物烯式吡蟲啉和吡蟲啉脲有吸附作用，使得其回收率降低。綜合考慮，本試驗使用PSA為凈化劑，結合適當的色譜分離條件，得到了滿意的結果。

根據2002年農藥殘留聯合專家會議(JMPR)報告，以14C標記的吡蟲啉對其代謝進行研究，以番茄為例，在溫室栽培條件下，對未成熟果實在收獲前14 d進行葉面噴施8 mL 0.2%的25%吡蟲啉可濕性粉劑(WP)溶液，用水量600 L·hm-2。測定結果為：放射性殘留總量(total radioactive residues,TRR)呈減少趨勢，從噴施后4 d的1.01 mg·kg-1到7 d和14 d后的0.84、0.85 mg·kg-1以至收后21 d的0.64 mg·kg-1；噴施后21 d，測得5-羥基吡蟲啉(0.027 mg·kg-1)占4.2%，烯式吡蟲啉(0.007 mg·kg-1)占1.1%。白雪松[27]研究了吡蟲啉及6-氯煙酸在玉米中殘留和消解動態，結果表明：吡蟲啉及其代謝產物6-氯煙酸在玉米植株中消解速率快，2 h后檢出6-氯煙酸，0～14 d吡蟲啉及6-氯煙酸的含量分別為1.23～0.46、0.04～0.40 mg·kg-1。Akoijam等[28]測定大米中的吡蟲啉和代謝產物的含量，其中吡蟲啉和代謝物(6-氯煙酸、烯式吡蟲啉和吡蟲啉脲)的總殘留量為4.57 mg·kg-1和13.94 mg·kg-1。Sharma等[29]研究吡蟲啉和6-氯煙酸在甘蔗葉片中的含量，發現施藥7 d后，其在甘蔗葉片中的含量分別為4.97 mg·kg-1和12.99 mg·kg-1。對比發現，利用本文的分析方法所測結果與文獻報道的結果類似但又有所不同，表明吡蟲啉及其代謝物在不同基質上檢出的時間和所占比例存在明顯的差異[30-31]，故而需要在建立分析方法的基礎上進行具體場景條件下的測定和研究。

4 結 論

本研究建立了以QuEChERS前處理為基礎的棉花葉片中吡蟲啉及其4種代謝物——吡蟲啉脲、烯式吡蟲啉、吡蟲啉胍和6-氯煙酸的高效液相色譜(HPLC)分析方法。以QuEChERS前處理方法為基礎，考察了方法的提取溶劑、鹽析材料和凈化劑種類及用量的影響。以有效去除基質中雜質干擾為前提，采用HPLC對樣品進行定量分析，驗證了方法的性能參數，結果表明本方法是一種簡單、快捷、可靠的檢測方法。