施用生物菌肥對桃園土壤養分及微生物功能多樣性的影響

于會麗，徐國益，徐變變，袁玉潔，邵 微,2，王新衛，朱更瑞，魯振華，司 鵬

(1.中國農業科學院鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009；2.河南農業大學林學院，河南 鄭州 450002)

生物菌肥是由一種或多種有益微生物經發酵而成的具有高效廣譜、綠色環保、安全無毒特性的生物性肥料[1-3]。除含有較高有機質外，還含具有特定功能的有益微生物，不僅活化土壤養分，改善土壤理化性質[4]和土壤微生物群落結構[5]，提高土壤肥力[6-8]，還促進作物養分吸收，提高作物產量和品質[9-10]，增強作物抗病和抗逆性[11-12]。劉德興等[13]在甜瓜上施用生物菌肥發現，生物菌肥能夠提高甜瓜單果重和改善甜瓜品質。陶愛群等[14]的研究表明，施用生物菌肥可改善玉泉冬棗的光合作用及提高果實產量和改善果實品質。

土壤微生物是土壤生態系統重要的組成部分和土壤養分循環的重要參與者[15]，在土壤有機物質分解、養分釋放和能量轉移中起著重要作用[16]。隨著人們對生物多樣性重要性認識的不斷深入，廣泛應用各種測定方法，如微生物醌法、脂肪酸法、TGGE、DGGE和Biolog 法等研究微生物代謝功能多樣性，微生物醌法、脂肪酸法、TGGE和DGGE等技術方法無法獲得有關微生物群落總體活性與代謝功能的信息[17]，Biolog 方法可克服這一缺點，被廣泛用于評價土壤微生物的功能多樣性[18]。司鵬等[19]通過Biolog 法研究表明，在葡萄行間種植毛葉苕子能顯著增加土壤微生物群落對六類碳源的利用。陳琳等[20]采用Biolog 法研究生物有機肥對板栗土壤微生物群落代謝活性的影響，結果表明，生物有機肥處理能提高土壤中微生物的活性。趙蘭鳳等[21]利用 Biolog 法分析了不同施肥處理對香蕉根際土壤微生物群落功能多樣性的影響，表明生物有機肥處理的根際微生物活性和土壤微生物對聚合物類和胺類的利用能力均高于對照和有機肥。然而有關生物菌肥對桃園土壤微生物功能多樣性影響的相關研究較少。

本研究采用 Biolog-Eco 板技術，研究生物菌肥不同施用量對桃園土壤微生物功能多樣性及有效養分的影響，明確其最佳施用量，為生物菌肥在桃生產上的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地基本情況

試驗區位于新疆西部中心昌吉國家農業園區老龍河大棚試驗基地(44°15′36″N，87°20′53″E)。海拔470 m，日照充足，年日照時數為2 700 h，年平均氣溫6.8℃，年平均降水量為190 mm，夏季降水量明顯多于冬季，年無霜期為175 d。

1.2 試驗設計

試驗于2018年9月15日進行，設置5個處理：雞糞2 000 kg·667m-2(CK)，生物菌肥200 kg·667m-2(T1)，生物菌肥300 kg·667m-2(T2)，生物菌肥500 kg·667m-2(T3)，生物菌肥1 000 kg·667m-2(T4)。每個處理設置3個小區，小區面積25 m2(5m×5m)，共種植18棵桃樹，隨機區組排列，每相鄰小區間隔1排桃樹作為保護行。單邊溝施，溝深30cm，溝寬30～40 cm，所有處理均將肥料一次性施入并與土混合均勻。

1.3 試驗材料

供試生物菌肥有效活益菌≥2×108CFU·g-1，功能菌為解淀粉芽孢桿菌和多粘類芽孢桿菌，有機質≥50%，蛋白質≥30%，N+P2O5+K2O≥10%，特別添加抗病性有益菌和鐵、錳、硼、鋅等微量元素，該產品執行NY884-2012肥料標準。對照用的雞糞有機質≥48.58%，N+P2O5+K2O≥10%。

1.4 土樣采集

2019年5月13日采集土樣，取樣方法為梅花形布點法，每個試驗小區選5個點，沿桃樹樹冠垂直投影面積2/3處取0～20 cm和20～40 cm土壤樣品，剔除石塊、植物殘根等雜物后，每個小區同層土樣混合。一部分土樣風干過篩進行土壤理化性質測定，一部分土樣貯藏于-80℃冰箱進行土壤微生物功能多樣性測定。

1.5 測定方法

1.5.1 土壤理化性質測定 土壤pH值采用pH計測定，水土比為2.5∶1；有機質采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法，有效磷采用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提法，速效鉀采用NH4OAc浸提-火焰光度法，硝態氮用酚二磺酸比色法，銨態氮用2 mol·L-1KCl浸提-靛酚藍比色法[22]。

1.5.2 土壤微生物群落測定 將相當于1 g烘干土的新鮮土壤加入到盛有99 mL 0.85%滅菌生理鹽水的250 mL 三角瓶中，28℃、200 r·min-1條件下振蕩培養30 min，使土樣與生理鹽水充分混勻，再放置在4℃冰箱內靜置30 min，然后加樣于Biolog-Eco板微孔板中，每孔加入150 μL。25℃下培養192 h，每24 h Biolog自動讀取儀讀數1次。

微生物群落功能多樣性的計算[23]：

Biolog-Eco板測定平均吸光值(average well color development，AWCD)，用來表示微生物的整體代謝活性[23]：

AWCD=∑(Ci-R)/n

Shannon-Wiener指數(H′)：

H′=-∑(Pi·lnPi)

Simpson 指數(D)又稱優勢度指數:

D=1-∑Pi2

Pielou均勻度指數(E)：

E=H′/lnS

豐富度指數(S)指被利用的碳源的總數，為每孔中(C-R)的值大于0.25的孔個數。

1.5.3 數據處理與分析 采用Microsoft Excel 2010進行數據處理；用SPSS 17.0統計軟件分別進行方差分析和主成分分析；用Canoco 4.5進行冗余分析(redundancy analysis，RDA)。

2 結果與分析

2.1 施用生物菌肥對桃園土壤養分的影響

生物菌肥對桃園土壤主要理化參數的影響見表1。隨生物菌肥施用量的增加，土壤pH值、有機質、硝態氮、銨態氮、有效磷和速效鉀含量呈先增加后降低趨勢。

表1 不同處理對土壤主要理化參數的影響

與CK相比，0～20 cm土層T1、T2和T3處理土壤pH值和有機質含量均增加，其中T1處理土壤pH值和有機質含量最高，分別增加3.08%和20.00%，但各處理間差異未達顯著水平。除T1處理外，生物菌肥處理的硝態氮含量均顯著低于CK，T2處理銨態氮含量較CK增加86.26%(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著。生物菌肥處理的土壤有效磷和速效鉀含量均高于CK，其中T3處理有效磷含量和T1處理速效鉀含量最高，較CK分別提高61.29%和277.43%(P<0.05)。

20～40 cm土層，與CK相比，生物菌肥處理土壤有機質和硝態氮含量降低，土壤pH值、銨態氮和速效鉀含量提高，其中，T1處理土壤pH值和速效鉀含量最高，較CK分別增加5.75%和265.71%(P<0.05)，且T1處理速效鉀含量與其他處理差異顯著。T3處理土壤銨態氮和有效磷含量最高，較CK分別增加53.59%和109.51%(P<0.05)。

2.2 施用生物菌肥桃園土壤微生物群落功能多樣性

2.2.1 土壤微生物平均吸光值變化特征 平均顏色變化率(AWCD)是表征土壤微生物群落對底物碳源利用強度的指標，AWCD值越大表明微生物密度越大，活性越高；反之微生物密度越小，活性越低[24]。由圖1可知，不同施肥處理下0～20 cm和20～40 cm 土層AWCD值隨培養時間的延長而升高。在24～96 h內，AWCD值迅速增加，這說明土壤微生物代謝能力增強，在培養96 h后，AWCD值增長趨于緩慢。在培養結束時，0～20 cm土層微生物活性AWCD高低依次為T2>CK>T3>T1>T4，20～40 cm土層微生物活性高低依次為T2>CK>T1>T3>T4，T2處理的AWCD值最高，說明在此條件下，生物群落代謝最快，活性最強，對碳源利用能力最高。

圖1 不同施肥處理土壤微生物平均吸光值隨培養時間的變化

2.2.2 不同施肥處理土壤微生物群落功能多樣性指數分析 選取土樣培養96 h數據進行土壤微生物代謝多樣性分析，不同施肥處理對桃樹土壤微生物群落功能多樣性指數影響不同，如表2所示，隨生物菌肥施用量的增加，土壤微生物群落功能多樣性指數呈先增加后降低趨勢。

表2 土壤微生物群落多樣性指數

0～20 cm土層，T2處理的土壤微生物群落優勢度指數、豐富度指數和多樣性指數最高，較CK分別增加0.21%、5.09%和0.92%，差異不顯著。T2和T3處理土壤微生物群落優勢度指數和均一性指數較T1處理分別提高0.42%、23.48%和0.42%、19.57%(P<0.05)。

20～40 cm土層，土壤微生物群落優勢度指數為T3>T2>T1>CK>T4，其中，T2和T3處理土壤微生物群落優勢度指數較CK分別提高0.22%和0.25%(P<0.05)，除T4外，生物菌肥處理間無顯著差異。T4處理的土壤微生物群落豐富度指數、均一性指數和多樣性指數顯著低于其他處理，且其他處理間無顯著差異。結果表明，T2處理增加土壤微生物群落多樣性指數，T4處理降低土壤微生物群落多樣性指數。

2.2.3 不同施肥處理土壤微生物對六類碳源的利用強度 由圖2可知，施生物菌肥處理與雞糞(CK)處理土壤微生物對Biolog-Eco板中不同類碳源利用強度存在差異，隨生物菌肥施用量的增加土壤微生物對Biolog-Eco板中每一類碳源的利用強度呈先增加后減少趨勢。

注: PM: 聚合物; CH: 碳水化合物; PA: 酚酸類化合物; CA: 羧酸類; AA: 氨基酸類; AM: 胺類,下同。不同字母表示在P<0.05水平下各處理差異顯著。Note: PM: polymer; CH: carbohydrate; PA: phenolic acid compound: CA: carboxylic acids; AA: amino acids; AM: amine. The same below. Different letters indicate the significant difference between different treatments (P<0.05).

0～20 cm土層，T2處理土壤微生物對羧酸類利用強度最高，較CK提高22.67%(P<0.05)，T4處理對聚合物和碳水化合物利用強度低于其他處理，較CK分別降低31.11%和23.91%(P<0.05)。

20～40 cm土層，與CK相比，T3處理對聚合物利用強度提高25.00%(P<0.05)，其他處理間無顯著性差異。T2處理對碳水化合物利用強度較CK和T4分別提高18.06%和30.77%(P<0.05)，與T1和T3處理差異不顯著。由此表明，T2處理促進土壤微生物對羧酸類和碳水化合物這兩類碳源的利用，T4處理抑制土壤微生物對六類碳源的利用。

2.3 土壤微生物功能多樣性與土壤養分之間的冗余分析

如圖3所示，冗余分析結果表明各個碳源之間存在相關關系。PM與AM呈顯著正相關性，相關系數為0.69；PA、AA、CA和AM呈極顯著正相關性，相關系數分別為0.85、0.80和0.80；CH與PA、CA呈顯著正相關性，相關系數分別為0.69和0.64；PA與CA、AA呈極顯著正相關性，相關系數分別為0.82和0.87;有機質與AA呈顯著正相關，相關系數為0.68;pH與速效鉀呈極顯著正相關關系，相關系數為0.85。

注: OM: 有機質; AP: 速效磷; AK: 速效鉀Note: OM: organic matter; AP: available phosphorus; AK: available potassium

2.4 生物菌肥對土壤微生物多樣性指數、碳源利用強度及土壤養分三因素綜合影響主成分分析

通過主成分分析可知(表3)，0～20 cm和20～40 cm土層，第1主成分特征值的變量解釋度分別為56.19%和56.15%，是最主要的解釋變量，前3個成分特征值的變量解釋度分別為93.62%和93.57%，表明這3個成分是主要分析部分。對各處理在4個成分中進行綜合評價(表4)，0～40 cm土層T2得分最高，分別為2.42和1.36，說明T2處理桃園土壤微生物多樣性指數、碳源利用強度及養分含量最高。

表3 指標總方差分解

表4 生物菌肥對土壤微生物多樣性指數、碳源利用強度及土壤養分三因素綜合影響評價

3 討 論

3.1 生物菌肥對桃園土壤養分的影響

生物菌肥能夠活化土壤養分，提高土壤養分有效性。研究結果表明，施用生物菌肥能提高桃園土壤有效磷和速效鉀含量，其中生物菌肥300 kg·667m-2效果最佳。可能因為生物菌肥中多數含有解淀粉芽孢桿菌等能夠活化土壤難溶性磷、鉀元素，從而提高有效磷和速效鉀含量[25]。柳曉磊等[26]研究表明，復合微生物菌與氨基酸水溶肥配施提高了土壤堿解氮、有效磷和速效鉀含量；叢山等[27]在番茄上的研究發現，微生物菌肥處理均能增加土壤速效鉀和有效磷含量。本研究發現，隨施肥量增加土壤有效磷含量先增加后降低，其中，施肥量在1 000 kg·667m-2時，20～40 cm土層土壤有效磷含量顯著低于其他菌肥處理。王立偉等[28]在番茄上施用生物菌肥也發現，生物菌肥可增加土壤中有效磷和速效鉀含量，隨生物菌肥施用量的增加先增加后降低。當施入土壤中的微生物菌劑過量時破壞了土壤中微生物的種群結構，進而影響土壤中磷素的有效性，使土壤有效磷含量降低[29]。同時發現，土壤有機質含量隨生物菌肥施用量的增加，總體呈現降低，這與前人研究結果相反[30]，可能是隨生物菌肥施用量的增加，促進了微生物對碳水化合物和氨基酸類物質的利用，而這類物質能夠產生正激發效應，加速土壤中有機質的腐解，土壤有機質含量降低[31]。另外，施用生物菌肥較對照降低了土壤硝態氮含量，與劉繼培等[32]研究不一致，可能與土壤中碳含量有關，C/N影響土壤中氮含量的轉化[33]，具體原因有待進一步研究。

3.2 生物菌肥對桃園土壤微生物功能多樣性的影響

Biolog-Eco板技術是通過測定土壤微生物對若干種不同單一碳源利用方式來鑒定微生物群落結構組成，其代謝活性差異來表征微生物種群變化和多樣性。多樣性指數用來反映土壤微生物群落功能[34]。本研究發現隨生物菌肥用量增加，土壤微生物活性和多樣性指數呈先增加后降低趨勢(如表4所示)，生物菌肥用量為300 kg·667m-2時，土壤微生物活性和群落多樣性最高，隨著用量增加土壤微生物活性和群落多樣性降低。一方面可能是由于生物菌肥用量過大，改變了土壤微生物優勢種群，促進某些微生物種群生長代謝，抑制其他微生物種群生長代謝，致使某些微生物功能群與其相關的特性消失，從而降低微生物代謝活性和微生物功能多樣性[35]；另一方面可能是該生物菌肥含有豐富的解淀粉芽孢桿菌，用量過大導致其分泌的抗生素、抗菌蛋白等物質抑制了真菌和其它類細菌的生長，致使土壤微生物功能多樣性減退[36]。因此，生物菌肥施用量對土壤微生物群落影響須控制在一定的范圍之內，過多則造成浪費，還影響其對土壤微生物效果的發揮。

本研究也表明，土壤有機質含量與微生物對氨基酸利用強度呈顯著正相關關系。主要因為氨基酸是土壤有機質的重要組成部分，增加土壤碳和氮含量[37]，為微生物創造更好生長環境，從而增強土壤微生物對氨基酸類化合物利用強度[38]，有機質為土壤微生物提供生長所需的能量和營養，土壤有機質含量與微生物群落活動關系密切[39]。同時研究發現，土壤速效鉀含量隨土壤pH值增加而增加，這與楊磊等[40]和林毅等[41]的研究相似，在一定范圍內，pH值越高，土壤速效鉀含量越高，高pH值能促使土壤速效鉀的釋放和轉移。

4 結 論

生物菌肥能夠提高新疆地區桃園土壤養分和土壤微生物對碳源利用的強度，增加土壤微生物活性和功能多樣性，其中，生物菌肥300 kg·667 m-2在改善桃園土壤養分以及微生物功能多樣性效果最佳。