干旱和鹽脅迫對不同種源地麻花艽幼苗生長和生理特性的影響

程庭峰,王 環,陳世龍,王久利,師生波,沈建偉,周黨衛,5

(1.中國科學院西北高原生物研究所高原生物適應與進化重點實驗室，青海 西寧 810008；2.中國科學院西北高原生物研究所分析測試中心，青海 西寧 810008；3.青海省作物分子育種重點實驗室，青海 西寧 810008；4.青海民族大學生態環境與資源學院，青海 西寧 810007；5.中國科學院大學，北京 100049)

麻花艽(GentianastramineaMaxim.) 為龍膽屬多年生草本植物[1]，《中國藥典》2015 年版將其和同為秦艽組(Sect.CruciataGaudi)的大葉秦艽 (G.macrophyllaPall.)、粗莖秦艽 (G.crassicaulisDuthie ex Burk.)、小秦艽 (G.dahuricaFisch.)一起列為中藥秦艽的4種基源植物，秦艽是一種傳統的中藏藥材，距今已有2000多年的歷史，具有祛風濕、清濕熱、止痹痛和退虛熱等功效[2]。研究發現生長在不同環境下的植物，經過自然選擇和適應，能夠在形態和生理特性等方面產生變異，最終形成特定的地理種源；麻花艽在我國主要分布于青藏高原及其周邊地區，推測不同種源麻花艽在長期的生長過程中也已經形成了適應多種生境的遺傳差異[3-4]。近年來，隨著市場需求量的增加，麻花艽野生資源遭到嚴重破壞，因此有必要開展麻花艽的人工栽培研究[5]。

鹽脅迫和干旱脅迫是植物最容易遭受的逆境脅迫，能夠通過滲透脅迫造成植物損傷，導致植物體內活性氧積累，是植物生長的限制性因素之一。我國存在大量的干旱鹽漬土地，其中又以西北地區(青海、甘肅、新疆)為主[6-8]。當前麻花艽人工種植在青海等地已經廣泛開展，因此，對脅迫下不同種源麻花艽生理特性的研究，將有助于抗旱耐鹽種質資源的篩選和培育，保證野生資源的可持續開發利用[9]。

目前，相關學者已經對麻花艽、秦艽等植物脅迫下的萌發特性進行了研究，但脅迫對其生理特性的影響卻鮮有報道[10-11]。本試驗以不同采集地點的麻花艽種子為研究對象，分別通過PEG6000、NaCl以及兩者混合模擬干旱脅迫、鹽脅迫和混合脅迫，分析不同脅迫對不同種源麻花艽幼苗的形態、可溶性蛋白、丙二醇以及抗氧化酶活性的影響差異，闡明干旱和鹽脅迫對麻花艽生理特性的影響，為其馴化栽培提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

麻花艽種子于2018年分別取材自青海省海北站(HBZ)、德令哈(DLH)、河北鄉(HBX)、下藏科(XZK)和班瑪縣(BMX)5個區域。晾干后選取籽粒飽滿、大小均勻、成熟的種子作為實驗材料。

將麻花艽種子置于300 μmol·L-1的赤霉素中浸泡24 h，分別用無菌水漂洗3次，75%的酒精消毒1 min、2.5%的NaClO溶液消毒10 min后，再用無菌水漂洗5次。將消毒后的種子接入30 mL MS固體培養基中，所有的培養瓶放到人工氣候培養箱中進行培養。大約3周后植株長至 2 cm 時，分別接入5 mL 10% PEG、150 mmol·L-1NaCl以及10% PEG+150 mmol·L-1NaCl混合溶液模擬干旱脅迫、鹽脅迫和混合脅迫，7 d后將材料取出，檢測麻花艽幼苗的株高、根長、鮮重以及鮮重下的可溶性蛋白和丙二醛含量、抗氧化酶活性等生理指標。

1.2 各生理指標的測定及其方法

可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍 G-250染色法；丙二醇(MDA)測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑(NBT)法測定；過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚比色法測定；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測定。

1.3 數據分析

實驗數據通過SPSS 20.0進行統計分析，采用Excel 2010進行繪圖。生長指標以 3次重復的平均值及其標準誤差表示。利用相對可溶性蛋白、相對MDA和相對抗氧化酶活性等指標，通過隸屬函數法對幼苗抗性進行綜合評價。

隸屬函數值的計算公式：

R(Xi) = (Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

反隸屬函數值計算公式：

R(Xi) = 1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，Xi為實驗材料在某一脅迫下的測定值；Xmax和Xmin分別為該脅迫下所有材料中該指標的最大值和最小值，計算完所有指標的隸屬值后，通過累加求平均，平均值越大，表明其抗性越強[12-13]。

2 結果與分析

2.1 不同脅迫對麻花艽幼苗生長的影響

雙因素方差分析結果顯示，采集地、脅迫及兩者的交互顯著影響麻花艽的生長(表1)。

表1 麻花艽幼苗生長的雙因素方差分析結果

不同脅迫對麻花艽幼苗的生長具有不同影響，如表2所示。與對照相比，除河北鄉和鹽脅迫下的海北站外，3種脅迫下幼苗的株高都出現降低，且混合脅迫下抑制作用更明顯；所有材料的根長在脅迫下都出現降低；河北鄉幼苗的鮮重在干旱脅迫下出現顯著增加(P<0.05)，其余地區材料有變化但無顯著性差異；海北站幼苗的根冠比在干旱脅迫下出現顯著降低(P<0.05)，其余材料出現變化但與對照間也無顯著性差異。

表2 脅迫對不同種源地麻花艽幼苗生長的影響

不同種源麻花艽種子對脅迫的響應也具有一定的差異，干旱脅迫下德令哈地區幼苗的株高最高，為2.36 cm；鹽脅迫和混合脅迫下河北鄉和德令哈地區幼苗的株高均顯著高于其他地區(P<0.05)，且河北鄉均為最高，分別為2.49 cm和2.28 cm。3種脅迫條件下，海北站根長最長。干旱脅迫下河北鄉地區幼苗鮮重最大，為7.61 mg；鹽脅迫下海北站鮮重最大，為6.94 mg;混合脅迫下德令哈鮮重最高，為6.48 mg。干旱脅迫下班瑪縣幼苗根冠比最大，為0.20;鹽和混合脅迫下海北站根冠比最大，分別為0.33和0.29。

2.2 不同脅迫對麻花艽幼苗丙二醇含量的影響

如圖 1所示，與對照相比，除干旱脅迫下的德令哈外，其他采集地麻花艽幼苗的MDA含量均出現增加，3種脅迫條件下班瑪縣MDA增加量均為最高，分別增加了1 509.75%,605.29%和1 175.76%。其中海北站、德令哈和河北鄉幼苗的MDA含量在混合脅迫下增加更為明顯，分別增加了833.92%,23.93%和242.05%，下藏科幼苗在鹽脅迫下增加最為明顯，增加了600.29%。

圖1 脅迫對麻花艽幼苗丙二醇含量的影響

2.3 不同脅迫對麻花艽幼苗可溶性蛋白含量的影響

如圖 2所示，不同地理種源麻花艽幼苗可溶性蛋白的含量在脅迫下呈現出不同的變化趨勢。與對照相比，干旱脅迫下海北站、德令哈和下藏科均顯著增加，分別增加了23.87%，46.52%和10.00%；鹽脅迫下德令哈的幼苗可溶性蛋白增加了12.15%，其余地區都出現降低，降幅不顯著；混合脅迫下所有材料可溶性蛋白都出現降低，其中海北站、德令哈和河北鄉顯著下降，分別下降了21.96%,18.32%和12.80%。

圖2 脅迫對麻花艽幼苗可溶性蛋白含量的影響

2.4 不同脅迫對麻花艽幼苗抗氧化酶活性的影響

如圖3所示，脅迫下不同地理種源麻花艽幼苗的抗氧化酶活性也出現不同變化。與對照相比，干旱脅迫下所有材料的SOD均出現降低，鹽脅迫下僅下藏科增加了17.23%，混合脅迫下僅德令哈地區增加了6.45%，其余地區均表現為降低(圖3A)。脅迫下POD活性也出現不同變化，干旱脅迫下除河北鄉外都出現增加，其中海北站增加最明顯，相較于對照增加了234.39%；鹽脅迫下除海北站增加了340.53%外，其余地區POD活性都出現下降；混合脅迫下除下藏科增加了88.18%倍外，其余地區也都出現下降(圖3B)。脅迫下多數地區幼苗的CAT活性出現降低，干旱和鹽脅迫下僅海北站分別增加了86.39%和127.86%，其余地區都出現下降；混合脅迫下海北站、德令哈和下藏科均出現顯著性增加，分別增加了12.83%、51.20%和26.57%(圖3C)。

圖3 脅迫對麻花艽幼苗SOD、POD和CAT活性的影響

2.5 不同種源麻花艽幼苗的綜合抗性評價

不同地理種源麻花艽的抗性隸屬函數分析如表3所示，其中相對可溶性蛋白、相對抗氧化酶活性計算采用隸屬函數公式，MDA與幼苗生長表現為負相關，其計算采用反隸屬函數公式。抗旱性綜合評價順序為：德令哈>海北站>下藏科>河北鄉>班瑪縣，耐鹽性順序為：海北站>下藏科>德令哈>班瑪縣>河北鄉，混合脅迫抗性順序為：德令哈>下藏科>河北鄉>海北站>班瑪縣。

表3 不同地理種源麻花艽的抗性隸屬函數值及綜合評價

3 討 論

3.1 不同脅迫對麻花艽生長的影響

脅迫能抑制植物的生長，本研究發現不同脅迫下大多數材料的生長受到明顯抑制，鮮重無顯著性變化，且混合脅迫下對株高的抑制更為明顯，這與李靜怡等[14]對天仙子NaCl和PEG脅迫的結果相一致。雖然脅迫下植物的生長受到抑制，但相關研究也發現，植物在水分脅迫下傾向于將更多的資源分配給根系，通過提高根冠比來適應干旱的環境[15]。本研究中植物脅迫下的根冠比并未出現明顯增加，但海北站幼苗的根冠比在脅迫下顯著高于其他地區，說明其對脅迫環境具有一定的適應性。

3.2 不同脅迫對麻花艽生理特性的影響

MDA能夠造成細胞膜的損傷，其含量高低可以作為植物抗性強弱的判定指標之一，多數植物在脅迫下MDA含量都會出現明顯升高[16]。本研究發現班瑪縣麻花艽幼苗在3種脅迫條件下MDA含量都出現明顯積累，遠大于其他地區，表明脅迫對其影響較大。而德令哈的MDA變化卻不明顯，干旱脅迫下更是出現明顯下降，表明其對脅迫的耐受性較強。脅迫下植物可以通過增加可溶性蛋白等滲透調節物質的含量降低自身對水分的需求。本研究發現干旱脅迫下海北站和德令哈地區幼苗可溶性蛋白含量出現明顯增加，鹽脅迫下僅德令哈地區出現增加，說明該地區植物對脅迫表現出一定的生理適應。李為民等[7]發現混合脅迫能夠導致野生大豆滲透調節物質可溶性糖含量的降低，本研究發現混合脅迫下所有地區可溶性蛋白含量都出現降低，推測可能是由于強脅迫下，高濃度的Na+導致細胞內外的離子平衡受到破壞，影響了可溶性蛋白的積累。

植物在脅迫條件下會出現活性氧的積累，其細胞膜結構會遭到破壞，導致生長受到抑制，植物會通過在體內建立一套相應的抗氧化保護酶系統(SOD,POD和CAT等)以維持其體內的活性氧動態平衡，實現對脅迫的耐受[7]。本研究中，大部分材料在鹽和混合脅迫下抗氧化酶活性都出現降低；干旱脅迫下POD活性出現增加，說明麻花艽對干旱具有一定的耐受性。陳鋒[17]對祁連山3種藥用植物抗旱性的研究也發現，干旱脅迫下麻花艽的SOD和POD出現升高，但隨著脅迫時間的增長，其抗氧化酶活性迅速降低，由此推測本研究中麻花艽幼苗抗氧化酶活性的降低，可能是由于強脅迫超過了保護酶系統的承受極限，導致抗氧化酶系統受到損傷[18]。雖然大部分麻花艽材料抗氧化酶活性出現了降低，但部分地區還是明顯升高，例如單純干旱和鹽脅迫處理下，海北站地區幼苗的POD和CAT活性出現明顯增加，混合脅迫下德令哈地區的SOD和CAT增加也最為明顯。說明這兩個地區的麻花艽在脅迫下抗氧化酶活力得到增強，其對脅迫的耐受性也強于其他地區的麻花艽。

3.3 不同種源麻花艽的抗逆性評價

模糊隸屬函數法現已廣泛應用于品種的抗逆性評價上，能夠綜合所有指標對植物進行客觀全面的評價，避免了單一指標評價的片面性[12-13,19]。本研究中，通過對麻花艽種質的抗逆性評價，發現德令哈和海北站的麻花艽抗旱性較強，海北站、下藏科和德令哈的抗耐鹽性較強，這也和形態指標表現相一致，脅迫下海北站和德令哈的麻花艽具有較高的株高、根長和根冠比。有趣的是，雖然海北站麻花艽具有較強的抗旱耐鹽性，但在混合脅迫下，其抗性卻遠低于德令哈，說明麻花艽對逆境的響應是一個復雜的過程，并不是單一累加的結果[14]。不同種源麻花艽抗性的差異也與種質所處的環境氣候條件相吻合，德令哈屬于柴達木盆地荒漠區，其年降水量較少，而班瑪縣則屬于川西藏東高山峽谷針葉林區，受印度洋季風的影響，其年降水量較多[20]，說明各地理種源麻花艽經過長期的自然選擇和環境適應對脅迫響應產生了一定的差異，原產地生長于寒冷干旱地區的植物, 對水分缺乏不敏感，例如德令哈、海北站地區。而溫暖濕潤地區, 例如班瑪縣的麻花艽，其對水分缺乏則較為敏感[21]。

4 結 論

綜上所述，脅迫對麻花艽的生長具有一定的影響，但其能夠通過植物形態、生理生化等機制的調節實現對脅迫的耐受，且不同地理種源麻花艽對脅迫耐受性存在一定的差異，其中海北站和德令哈地區的麻花艽由于長期受自然環境的影響具有較強的抗性，主要通過增加滲透調節物質含量、提高抗氧化酶活性等機制，實現了對脅迫的耐受。后續應加強對具體調節機制的研究，擴大材料的選取范圍，為麻花艽優質種質資源的引進栽培提供理論依據。