黑果枸杞多糖對(duì)菌群人源化小鼠腸道微生物調(diào)節(jié)研究

王莉 林芝雨 龐旭濤 劉健

摘要?[目的]以菌群人源化小鼠（HFA-小鼠）作為模型，研究不同濃度黑果枸杞多糖對(duì)HFA小鼠腸道微生物的影響。[方法]征集一名健康志愿者，通過接種志愿者的糞便懸液構(gòu)建HFA小鼠模型，將40只HFA小鼠隨機(jī)分為4組，黑枸杞多糖低劑量組（CT+LPL）灌胃枸杞多糖50 mg/kg，黑枸杞多糖中劑量組（CT+LPM）灌胃枸杞多糖100 mg/kg，黑枸杞多糖高劑量組（CT+LPH）灌胃枸杞多糖200 mg/kg，正常對(duì)照組（CT）每天灌胃同體積的生理鹽水。連續(xù)灌胃21 d，試驗(yàn)期間記錄各組小鼠的體重變化，第22天處死小鼠后，取標(biāo)本進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。[結(jié)果]CT+LPM組小鼠體重低于CT組，呈顯著性差異（P<0.05），CT+LPM組HFA小鼠腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量較CT組均增加，腸桿菌和腸球菌數(shù)量均減少，差異顯著（P<0.01），CT+LPM組HFA小鼠腸黏膜sIgA含量極顯著高于CT組（P<0.01）。[結(jié)論]黑枸杞多糖能夠改善HFA小鼠腸道菌群環(huán)境，具有益生元作用，也能促進(jìn)HFA小鼠腸黏膜sIgA的分泌。

關(guān)鍵詞?黑枸杞多糖;菌群人源化小鼠;腸道菌群;免疫球蛋白A

中圖分類號(hào)?TS?201.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2020）01-0178-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.054

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Regulation Research of Lycium ruthenicum Polysaccharide on Gut Microbes in HFA Mice

WANG Li，LIN Zhi?yu，PANG Xu?tao et al

（College of Science and Technology，Nanchang University，Nanchang，Jiangsu 330029）

Abstract?[Objective]To study the effects of different concentrations ofLycium ruthenicum polysaccharide on the gut microbes of HFA mice using the source?based mice （HFA?mice） as a research model.[Method]A healthy volunteer was recruited to construct a HFA mouse model by inoculating the volunteers faecal suspension， 40 HFA mice were randomly divided into four groups，with theLycium ruthenicum polysaccharide low dose group （CT?LPL） infused with polysaccharide 50 mg/kg，and theLycium ruthenicum polysaccharide medium dose group （CT?LPM） infused with polysaccharide 100 mg/kg，the high?dose group ofLycium ruthenicum polysaccharide（CT?LPH） infused with polysaccharide 200 mg/kg，the normal control group （CT） infused the stomach with the same volume of saline every day.The weight changes of each group of mice were recorded during the experiment，execution of the mice after 21th day，the samples were tested for various indicators.[Result]Compared with the CT group，the weight of the mice in the CT?LPM group decreased significantly，showing significant differences （P<0.05），the number of Lactobacillus and Bifidobacterium in the intestines of the HFA mice in the CT?LPM group increased，the number of Enterobacteriaceae and Enterococcus decreased，and the difference was statistically significant （P<0.01），the content of intestinal mucosa sIgA in the CT+ LPM group was significantly higher than CT group （P<0.01）.[Conclusion]Lycium ruthenicum polysaccharide can improve the environment of intestinal microbe in HFA mice，which have a probiotic effect，and can also promote the secretion of sIgA in HFA mice.

Key words?Lycium ruthenicum polysaccharide;Human flora?associated mice;Gut microbes;Immunoglobulin A

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）為茄科、枸杞屬，主要分布于我國陜西北部、寧夏、甘肅等地，成熟干燥時(shí)食用，黑枸杞味甘、性平、清心熱。黑枸杞多糖（Lycium ruthenicum polysaccharide.LP）具有抗疲勞、消炎、抗氧化、降血糖、改善機(jī)體免疫等多種保健功能[1-2]。天然藥物多糖對(duì)腸道微生物菌群失調(diào)有良好的調(diào)節(jié)作用，如黃芩多糖、靈芝多糖、蒲公英多糖等[3-5]，目前黑果枸杞多糖對(duì)腸道微生物微生態(tài)調(diào)節(jié)方面的文章鮮有報(bào)道。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生理代謝及腸道菌群組成與人的腸道菌群組成和代謝有明顯差異，利用動(dòng)物模型研究腸道菌群對(duì)動(dòng)物各種疾病及健康的影響已有很多，但要研究人腸道菌群對(duì)人類疾病及健康的影響卻比較困難，HFA（human flora?associated）小鼠能相對(duì)真實(shí)地反映人腸道中的菌群環(huán)境，該模型已被證實(shí)在腸道菌群的研究方面是可行的，并且可有效地避免人體實(shí)驗(yàn)的倫理問題[6-7]。筆者擬用HFA小鼠，研究黑枸杞多糖對(duì)小鼠腸道菌群中細(xì)菌的影響，為膳食營養(yǎng)干預(yù)腸道菌群提供理論參考。

1?材料與方法

1.1?動(dòng)物、材料與試劑?無菌昆明（KM）小鼠，由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

黑果枸杞產(chǎn)地為甘肅銀川，經(jīng)鑒定為茄科植物黑果枸杞的成熟果實(shí)，黑枸杞多糖由筆者所在實(shí)驗(yàn)室提取純化。

BS、MRS、EC、EMB培養(yǎng)基（天根生化科技有限公司）;sIgA試劑盒（上海康朗生物科技有限公司）;乙醇、苯酚、瓊脂、葡萄糖均為國產(chǎn)分析純。

1.2?儀器與設(shè)備?JJ-CJ-1D超凈工作臺(tái)（成都一科儀器設(shè)備有限公司）;BKQ-B100II滅菌鍋（廣州市科洋醫(yī)療設(shè)備有限公司）;DHP-500電熱恒溫培養(yǎng)箱（常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）;EU-2800DS紫外可見光分光光度計(jì)（上海美析儀器有限公司）;Thermo多功能酶標(biāo)儀（山東博科科學(xué)儀器有限公司）;N-110-D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器設(shè)備有限公司）;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）（上海楷岳生物科技有限公司）。

1.3?方法

1.3.1?黑枸杞多糖的制備。

取黑果枸杞干粉末5.0 g，80%乙醇預(yù)處理，按提取溫度90 ℃，液料比30∶1，提取時(shí)間2 h，提取2次后，濃縮水提液，加入氯仿∶正丁醇=5∶1試劑，充分振蕩離心6次，95%乙醇溶液攪拌，冷藏過夜，離心，70%乙醇洗滌，減壓干燥得黑枸杞多糖[8]。

1.3.2?HFA小鼠模型的構(gòu)建。

無菌KM小鼠40只，4周齡，體質(zhì)量（25±2）g，雌雄各50%。招募一位體格健康的志愿者（女，25歲，無消化道及代謝疾病，90 d內(nèi)未服用抗生素），取志愿者清晨第1次排出的糞便，無菌收集，1 h內(nèi)在無菌厭氧條件下稱重，以質(zhì)量比1∶9（m∶V）加入Wikins-Chalgren厭氧肉湯（Oxoid）稀釋，振蕩混勻后獲得懸液。取懸液灌胃（每只小鼠0.3 mL）接種于40只無菌KM小鼠體內(nèi)，人腸道菌群在小鼠腸道內(nèi)定殖21 d后得到HFA小鼠模型[9]。

HFA小鼠飼育于無菌動(dòng)物房內(nèi)，環(huán)境溫度20～23 ℃，濕度40%～70%，12 h光照+12 h黑暗，無菌鼠基飼料、無菌水飼育，實(shí)驗(yàn)期間自由攝食飲水。

1.3.3?動(dòng)物分組和給藥。

將40只HFA小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：正常對(duì)照組（CT）、黑枸杞多糖低劑量組（CT+LPL）、黑枸杞多糖中劑量組（CT+LPM）、黑枸杞多糖高劑量組（CT+LPH）。實(shí)驗(yàn)期間，每天對(duì)小鼠進(jìn)行定時(shí)灌胃，枸杞多糖低劑量組，灌胃枸杞多糖50 mg/kg;枸杞多糖中劑量組，灌胃枸杞多糖100 mg/kg;枸杞多糖高劑量組，灌胃枸杞多糖200 mg/kg，正常對(duì)照組每天灌胃同體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃21 d，飼養(yǎng)期間小鼠自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)期間記錄各組小鼠的體重變化，第22天處死小鼠后，取標(biāo)本進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.4?小鼠腸道菌液的制備及接種。

將小鼠固定于解剖板上，75%乙醇消毒皮膚后，切開腹部，無菌采集盲腸內(nèi)容物，置內(nèi)容物于無菌試管中，超凈工作臺(tái)上稱取1.0 g盲腸內(nèi)容物，加9 mL無菌生理鹽水混合，振蕩器上振蕩15 min，得腸內(nèi)容物懸液。取裝有9 mL滅菌生理鹽水的試管6支，依次稀釋盲腸內(nèi)容物，直至稀釋倍數(shù)為10-5。 樣品稀釋度按照雙歧桿菌（10-3、10-4、10-5）、乳酸桿菌（10-3、10-4、10-5）、腸桿菌（10-2、10-3、10-4）、腸球菌（10-2、10-3、10-4），用移液器取不同稀釋度的樣品0.2 mL于不同的選擇培養(yǎng)基上，涂布培養(yǎng)，每個(gè)稀釋度下每種培養(yǎng)基做3個(gè)平行板。

1.3.5?小鼠腸道菌群的培養(yǎng)及計(jì)數(shù)。小鼠腸道內(nèi)容物培養(yǎng)細(xì)菌名稱、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、鑒定方法等見表1。

培養(yǎng)結(jié)束后，常規(guī)平板活菌計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，計(jì)算出各種菌落同一稀釋度的平均菌落數(shù)α，根據(jù)公式分別計(jì)算各種菌落3種稀釋度樣品的菌落總數(shù)，最終結(jié)果以每克糞便中菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值表示。計(jì)數(shù)時(shí)選取平板菌落數(shù)為30～300個(gè)的平板為宜[10]。

菌落總數(shù)[lg（CFU/g）]=α×稀釋倍數(shù)0.1×1.0

1.3.6?小鼠腸黏膜 sIgA含量的檢測(cè)。

取小鼠腸道末端2 cm回腸置于無菌燒杯中，以無菌冰浴磷酸鹽緩沖液（phosphate buffeed saline，PBS）沖洗回腸腔，至糞便全部去除，取1 g回腸黏膜加5 mL PBS緩沖液，在冰上用10 mL玻璃勻漿器進(jìn)行勻漿處理，4 ℃下1 000 r/min離心10 min，收集上清液置于-20 ℃?zhèn)溆谩０磗IgA試劑盒說明書測(cè)定回腸黏膜中分泌型免疫球蛋白含量[11]。

1.4?統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均值（±S）表示，顯著性分析采用單項(xiàng)方差分析，組間多重比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果與分析

2.1?黑枸杞多糖對(duì)HFA小鼠體重的影響

由表2可知，與試驗(yàn)前相比，試驗(yàn)后各組小鼠的體重都有明顯增加。與CT組相比較，CT+LPL組和CT+LPH組小鼠體重均有增加，但無顯著性差異（P>0.05）;CT+LPM組小鼠體重明顯低于CT組，呈顯著性差異（P<0.05）。說明黑枸杞多糖可有效控制HFA小鼠體重，對(duì)HFA小鼠腸道微生物代謝有一定的調(diào)節(jié)作用，可影響機(jī)體能量代謝。

2.2?黑枸杞多糖對(duì)HFA小鼠腸道菌群的影響

由表3可知，與CT組相比，3個(gè)劑量組HFA小鼠腸道中乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量都顯著增加，而腸桿菌、腸球菌數(shù)量顯著下降（P<0.05）。與CT組相比較，CT+LPM組HFA小鼠腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量均增加，腸桿菌和腸球菌數(shù)量均減少，差異顯著（P<0.01）;與CT組相比較，CT+LPH和CT+LPL組HFA小鼠腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量均增加，腸桿菌和腸球菌數(shù)量均減少，差異顯著（P<0.05）。說明黑枸杞多糖可調(diào)節(jié)HFA小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加有益菌在HFA小鼠腸道中的定殖力。

2.3?HFA小鼠腸黏膜sIgA含量

由表4可知，與CT組相比較，3個(gè)劑量組腸黏膜sIgA含量均有所升高，差異顯著（P<0.05）。其中CT+LPM組腸黏膜sIgA含量極顯著高于CT組（P<0.01）;CT+LPM組腸黏膜sIgA含量顯著高于CT+LPH和CT+LPL組（P<0.05）。說明黑枸杞多糖可以改善腸道sIgA含量，但腸道中sIgA含量并非隨著黑枸杞多糖添加量增多而升高。

3?討論

近年來，腸道菌群對(duì)人類健康的影響受到越來越廣泛的關(guān)注，一方面腸道菌群不僅促進(jìn)人體健康，調(diào)節(jié)人體代謝;另一方面人類的某些疾病是因腸道微生物失衡造成的，比如肥胖、乳糜瀉、炎癥性腸道疾病等[12]。肥胖在我國已成為青少年健康的最大危害因素之一，已有研究發(fā)現(xiàn)肥胖和個(gè)體腸道微生物菌群之間有著密切的關(guān)系[13]。隨著越來越多學(xué)者對(duì)腸道菌群的研究發(fā)現(xiàn)通過移植外援腸道微生物群可以恢復(fù)患者腸道微生物群落平衡，此項(xiàng)技術(shù)可以作為對(duì)某些疾病治療的有效手段[14]。利用動(dòng)物模型研究食物及藥物對(duì)人類疾病的影響是臨床上常用的研究方法，但動(dòng)物與人的腸道菌群種類不同，生理代謝也有明顯差異。該試驗(yàn)構(gòu)建的菌群人源化動(dòng)物模型，比普通動(dòng)物模型在研究腸道微生態(tài)方面更具有優(yōu)勢(shì)。

腸道菌群在機(jī)體腸道中存在動(dòng)態(tài)平衡，維持機(jī)體正常代謝，而雙歧桿菌和乳桿菌為腸道中的優(yōu)勢(shì)菌，可抑制病原菌在腸道的定殖，維持腸道微生態(tài)平衡。在該試驗(yàn)中，與空白組相比較，3個(gè)劑量組HFA小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌菌群數(shù)量都有明顯增加（P<0.05或P<0.01），腸桿菌和腸球菌數(shù)量減少（P<0.05），說明黑枸杞多糖能夠調(diào)節(jié)腸道菌群，刺激腸道內(nèi)原有有益菌雙歧桿菌和乳酸桿菌的增殖，抑制腸桿菌和腸球菌的繁殖，起到益生元的作用。

sIgA是腸黏膜上的主要免疫球蛋白，作為腸道黏膜上的第一道防線，其可以阻止各種內(nèi)源性共生菌及外源性致病菌的侵入。該試驗(yàn)中，與空白組相比較，3個(gè)劑量組HFA小鼠腸道黏膜sIgA含量都增加（P<0.05或P<0.01），說明黑枸杞多糖能促進(jìn)HFA小鼠腸黏膜sIgA的分泌，增強(qiáng)HFA小鼠腸道免疫功能。而腸黏膜液sIgA也對(duì)腸道菌有調(diào)節(jié)作用，可以促進(jìn)腸道菌群平衡，阻止食物中外來致病菌的侵入，進(jìn)一步保護(hù)平衡腸道微生物菌群，提高機(jī)體免疫力。

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