產廣譜細菌素芽孢菌篩選與鑒定

滿文曾 胡容 封嗣中 嚴銘璽 張雷春雨 楊煥 周濤

摘要?為篩選出可產抑菌肽的芽孢菌，采用稀釋涂布、平板劃線的方法從土壤、泡菜、湖泥等10種樣品中分離純化菌種，利用抑菌圈法篩選出有4株抑菌性的芽孢菌，對抑菌效果最好的菌株J11通過菌落形態、革蘭氏染色、芽孢染色、生理生化試驗以及16SrDNA測序鑒定，表明其為多粘類芽孢桿菌，并進一步測定J11的抑菌譜，結果表明其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、溶酪巨型球菌、戊糖片球菌、瑞士乳酸桿菌、乳酸鏈球菌均具有一定的抑菌性。尤其對溶酪巨型球菌的抑菌圈直徑達30.13 mm，抑菌作用非常明顯。J11具有良好的抑菌性，具有廣譜抑菌效果，對常見的致病菌和腐敗菌都有一定的抑菌性，在食品保藏中具有一定的應用價值。

關鍵詞?篩選;細菌素;芽孢菌;抑菌性

中圖分類號?TS?202.3文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2020）01-0173-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.052

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Screening and Identification ofBacillus Strain Producing Bacteriocin

MAN Wen?zeng， HU Rong， FENG Si?zhong et al

（Department of FoodScience andEngineering， Nanjing Normal University， Nanjing，Jiangsu 210097）

Abstract?In order to screen Bacillus strain producing bacteriocin， four Bacillus strains were isolated and purified from soil， pickles， lake mud and other samples by dilution coating and plate marking. Antibacterial bacteria were screened by the method of bacteriostasis circle. The bacterial strains were identified by colony morphology， gram staining， spore staining， physiological and biochemical experiments and 16SrDNA sequencing. Finally， the bacteriostasis circle was used to determine the bacteriostasis circle size of the strains against various indicator bacteria and the bacteriostasis spectrum was obtained. The best bacteriostasis strain J11 was identified as Bacillus polymyxa. J11 was tested for Enterobacter， Staphylococcus aureus， Bacillus subtilis， Bacillus cereus， Caseinolyticus megacoccus， Pentosacoccus， Lactobacillus Switzerland and Streptococcus lactis. The bacteria had certain bacteriostasis. The diameter of bacteriostasis circle for Megacoccus casei was 30.13 mm， which was extremely sensitive to bacteriostasis. J11 had good bacteriostasis and broad?spectrum bacteriostasis effect， which had certain bacteriostasis to common pathogenic bacteria and spoilage bacteria， and had certain application value in food preservation.

Key words?Screen;Bacteriocin;Bacillus;Antibacterial activities

微生物引起的食品腐敗是改變食品物理化學性質、降低或失去食品營養價值和商品價值的過程，縮短了食品的貨架期，同時也造成大量食品的浪費[1]。尋找有效的食品防腐保鮮方法一直是人們研究的熱點問題，使用防腐劑、滅菌處理以及采用一些特殊的包裝方法可以抑制食品微生物繁殖，減慢食品變質的速度，其中使用化學防腐劑是目前最廣泛的食品防腐方法，如使用苯甲酸鈉鹽、山梨酸鉀鹽等。但越來越多的研究表明化學防腐劑有一定的危害作用，朱沁玲等[2]研究苯甲酸鈉多次給藥對雌性大鼠肝臟、腎臟及卵巢毒性，發現苯甲酸鈉多次給藥對大鼠肝臟、腎臟的功能均有損害，濃度越高，毒性越大。化學防腐劑越來越不能滿足人們對食品安全的高要求，人們也正在竭力尋找一些安全高效的天然防腐劑，如一些天然植物的提取物、中草藥提取物[3-4]，但天然植物抑菌物質存在提取率低的問題。細菌素作為一種生物性的天然防腐劑受到了廣泛的關注，細菌素是細菌在代謝過程中產生的一類具有抑菌作用的多肽類物質，在人體內可被代謝分解，安全性很高。微生物種類繁多，是開發細菌素的豐富資源[5]，其中芽孢菌環境適應性強且分布廣泛，是產細菌素的潛力菌種[6-7]。筆者利用稀釋涂布和平板劃線的方法從土壤、泡菜、湖泥等樣品中分離純化菌株，采用抑菌圈法篩選出具有廣譜抑菌效果的產細菌素芽孢菌[8-10]，并鑒定菌株種屬，測量其抑菌譜，以期篩選到具有廣譜抑菌效果的新菌株，擴大產細菌素菌種的同時促進天然防腐劑細菌素的開發和利用。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?樣品。

土壤分別來自江蘇南京、江蘇連云港、湖北恩施、貴州遵義、安徽六安的農耕地;南京市玄武湖湖泥;南京上海路市售泡白菜、泡蘿卜。

1.1.2?培養基。

LB固體培養基、LB液體培養基、NA固體培養基;PDA馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、高氏一號培養基[11]。

1.1.3?指示菌。

微生物菌種均由食品系微生物實驗室提供。以革蘭氏陰性菌代表菌大腸桿菌、革蘭氏陽性菌代表菌金黃色葡萄球菌作為抑菌性鑒定指示菌，其余作為抑菌譜測定的指示菌。

1.1.4?主要儀器與設備。

CJ-2S超凈工作臺（天津市泰斯特儀器有限公司）;

HVE-50高壓滅菌鍋（南京博惠科學儀器有限公司）;

HPX-9082 ME數顯恒溫培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）;

TH2-C恒溫搖床（太倉市實驗設備廠）;

TH4-200倒置熒光顯微鏡（南京奧力科學儀器有限公司）;

AUY200電子分析天平（日本ShiMADzu）;

PHS-3C精密pH計（上海三信儀表廠）;

DK-8D電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）;

GL-ZZM高速冷凍離心機（賽特湘怡離心儀器有限公司）。

1.2?方法

1.2.1?菌種分離與篩選。

取1 g樣品放入10 mL無菌水中充分混勻，80 ℃加熱30 min殺死營養細胞，制成1∶10的樣品勻液。然后用無菌水按10倍梯度稀釋5個梯度濃度，分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，每個梯度濃度吸取0.1 mL于LB固體培養基均勻涂布后置于37 ℃的培養箱中培養24 h。初步根據菌落形態判斷不同的菌株，分別挑取不同的菌株進行劃線純化，劃線3～4次得到純種的菌株。

1.2.2?抑菌試驗。

細菌的抑菌性測定采用抑菌圈法，以抑菌圈直徑判斷其抑菌性的大小。

挑取純種菌株接種到5 mL 的LB液體培養基中，置于37 ℃搖床培養18 h后作為種子液，將種子液按2%的接種量接種到50 mL液體培養基中37 ℃搖床培養18～22 h，取適量發酵液置于4 ℃、10 000 r/min的離心機中離心15 min去除細菌細胞，得到細菌的發酵上清液，取0.1 mL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均勻涂布在NA固體培養基作為指示菌，用打孔器在每個培養基上打出3個孔，然后注入適量的發酵上清液，不宜溢出。置于37 ℃培養箱培養6～8 h后觀察有無抑菌圈并測量抑菌圈直徑[12-13]（抑菌圈直徑包括打孔器直徑，打孔器直徑為8 mm）。

1.2.3?細菌素檢驗。

取發酵上清液測量其pH，將酸性發酵上清調至堿性以排除有機酸的影響，做抑菌試驗觀察其抑菌圈大小變化。然后進行酶解試驗，先取適量發酵上清液測量其pH，按1 mg/mL的比例分別加入蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶，調節pH到相應酶的最適pH（分別為7.4、6、7.4和2.0）后37 ℃水浴反應1 h，調回原液的pH后做抑菌試驗，觀察其抑菌圈大小變化[14]。

1.2.4?菌種鑒定。

對菌株進行革蘭氏染色和芽孢染色[15]，觀察其顏色反應。將初步確定為芽孢菌的菌株送往菌種鑒定機構——生工生物工程（上海）股份有限公司進行16SrDNA測序鑒定其具體的菌屬。

1.2.5?抑菌譜測定。

將各種指示菌培養至對數期作為抑菌試驗的指示菌，取J11的發酵上清液進行抑菌試驗，測定其對各種指示菌的抑菌圈大小，得到J11的抑菌譜。

2?結果與分析

2.1?產細菌素菌株的篩選結果

通過細菌的分離純化，從10種樣品中分離篩選出48株純種菌株，對該48株純種菌株進行抑菌試驗，獲得16株具有一定抑菌性的菌株，表1為該16株菌株對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑。其中J11、W1、Plb3、PC12這4株菌抑菌性較好，抑菌圈直徑在15 mm以上。

2.2?抑菌物質細菌素鑒定結果

為排除有機酸對微生物的抑菌作用，對抑菌性較好的J11、W1、Plb3、PC12進行排除有機酸試驗，測得其發酵上清液的pH都大于7，呈堿性，可以有效排除有機酸的影響。對其發酵上清液進行酶解試驗，酶解試驗結果如表2所示，J11被胰蛋白酶、胃蛋白酶酶解，W1、PC12能被蛋白酶K酶解， Plb3能被胰蛋白酶酶解。由此可確定J11、W1、Plb3、Plb3的抑菌物質是肽類物質細菌素。

2.3?菌種鑒定結果

對抑菌最好的J11菌株進行菌種鑒定，革蘭氏染色呈陽性，芽孢染色可以看到綠色芽孢以及細菌形態呈桿狀，可以初步確認其為芽孢桿菌，PCR擴增J11的16SrDNA基因序列為1 494 bp，將J11的16SrDNA 基因序列堿基序列進行 Blastn和數據庫中16SrDNA 序列進行核苷酸同源性比較，發現其與Paenibacilluspolymyxa IAM 13419 16SrDNA和PaenibacilluspolymyxaHBUAS57026 16SrDNA的序列相似率為99%。取上述序列和Paenibacillus thiaminolyticus、Paenibacillus kobensis、Bacillus cytotoxicus、Bacillus subtilis、Paenibacillus dauci、Paenibacillus massiliensis、Paenibacillus lautus、Paenibacillus hemerocallicola模式菌株的 16SrDNA 進行系統發育分析，構建了J11的系統發育進化樹，結果如圖1所示，確認J11為多粘類芽孢桿菌[16-18]。

2.4?抑菌譜測定結果

選擇16種指示菌進行抑菌試驗，得到J11的發酵上清液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、溶酪巨型球菌、戊糖片球菌、瑞士乳酸桿菌、乳酸鏈球菌都有抑菌效果，抑菌圈直徑如表3所示，其中對溶酪巨型球菌的抑菌性最敏感，抑菌圈直徑達30.13 mm。J11抑菌效果見圖2。

3?結論

從湖泥中篩選出一株具有廣譜抑菌效果的新菌株J11，通過對J11的發酵上清液進行排除有機酸和酶解試驗，確定其抑菌物質為細菌素。對其進行革蘭氏染色和芽孢染色以及16SrDNA測序，鑒定其為多粘芽孢桿菌。并測得其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、溶酪巨型球菌、戊糖片球菌、瑞士乳酸桿菌、乳酸鏈球菌都有抑菌效果，具有廣譜的抑菌性，且抑菌性良好，可抑制食品常見的腐敗菌和致病菌，在食品防腐保鮮中有一定的使用價值。

參考文獻

[1] 何國慶，賈英民，丁立孝.食品微生物學[M].3版.北京：中國農業大學出版社，2016.

[2] 朱沁玲，余蓓，蒲玟靜，等.食品防腐劑苯甲酸鈉多次給藥對雌性大鼠肝臟、腎臟及卵巢毒性的研究[J].廣東醫學，2018，39（3）：355-358.

[3] 丁捷楓，王強勝，李建芬.天然植物源食品防腐劑的研究進展[J].武漢輕工大學學報，2015，34（1）：26-31.

[4] 王曄，張輝華，胡民強.中草藥及其提取物在食品防腐中的應用研究進展[J].佛山科學技術學院學報（自然科學版），2015，33（1）：5-9.

[5] 孫兆竹，申秋華，白文杰.乳酸鏈球菌肽的特性及其在食品工業中的應用[J].安徽農業科學，2013，41（13）：5949-5951.

[6] MATARAGAS M，MELAXOPOULOUS J，DROSINOS E H A.Characterization of two bacteriocins produced by Leuconostoc mesenterioides L124 and Lactobacillus curvatus L442，isolated from dry fermented sausages[J].World J Microbiol Biotechnol，2002，18（9）：847-856.

[7] KEMPERMAN R，KUIPERS A，KARSENS H，et al.Identification and characterization of two novel clostridial bacteriocins，circularin A and closticin 574 [J].Appl Environ Microb，2003，69（3）：1589-1597.

[8] 張紅梅，符丹丹，趙君峰，等.泡菜中抑菌性芽孢桿菌的篩選及其細菌素理化特性[J].食品工業科技，2018，39（14）：110-114，119.

[9] 馮勁，周少璐，顧振東，等.產細菌素的細菌篩選鑒定及其產物抑菌性能研究[J].工業微生物，2017，47（5）：31-35.

[10] 胡敏，郝林，賈麗艷.枯草芽孢桿菌產細菌素發酵條件的優化[J].食品科學，2014，35（9）：198-202.

[11] AN J Y，ZHU W J，LIU Y，et al.Purification and characterization of a novel bacteriocin CAMT2 produced by Bacillus amyloliquefaciens isolated from marine fish Epinephelus areolatus[J].Food control，2015，51：278-282.

[12] 陳雪，侯紅漫，陳莉，等.產細菌素芽孢桿菌的篩選及發酵條件的研究[J].中國釀造，2008（9）：26-30.

[13] 林文憑.Bacillus subtilis ZJU15產生的抗菌肽研究[D].杭州：浙江大學，2010.

[14] 嚴濤，朱建國，姜甜，等.一株凝結芽孢桿菌的分離篩選及產孢條件優化[J].微生物學通報，2018，45（2）：238-249.

[15] 羅寶龍，魏軍林，黃麗麗，等.一豬源產細菌素芽孢桿菌的篩選及抑菌特性[J].微生物學通報，2018，45（6）：1342-1349.

[16] 鐘小廷.產細菌素蠟樣芽孢桿菌的篩選、鑒定及其培養基優化[D].成都：西華大學，2014：15-16.

[17] CAROLISSEN?MACKAY V，ARENDSE G，HASTINGS J W.Purification of bacteriocins of lactic acid bacteria：Problems and pointers[J].International journal of food microbiology，1997，34（1）：1-16.

[18] CHEN C Z，COOPER S L.Interactions between dendrimer biocides and bacterial membranes [J].Biomaterials，2002，23（16）：3359-3368.