基因型對粳稻花藥培養效率的影響

甘泉 宋豐順 滕斌 林翠香 倪大虎

摘要?[目的]研究基因型對粳稻花藥培養效率的影響。[方法]利用水稻花藥培養技術，對16個農藝性狀優良的粳稻品種進行了花藥離體培養。根據其愈傷誘導率和綠苗分化率，篩選花藥培養力強的優良粳稻品系。[結果]17y155適用為花藥培養F1代的親本，在水稻花藥培養領域有很大的應用潛力。[結論]該研究對水稻花藥培養高效體系的建立以及創制優良水稻新品系具有重要意義。

關鍵詞?粳稻;花藥培養;培養力;基因型

中圖分類號?S?511.2+2文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2020）01-0039-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.011

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effects of Different Genotypes on Anther Culture Efficiency of Japonica Rice

GAN Quan， SONG Feng?shun， TENG Bin et al

（Rice Research Institute， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230001）

Abstract?[Objective] To research the effects of different genotypes on anther culture efficiency of Japonica rice. [Method]Cultivation technology of anther culture was adopted to carry out the in vitro cultivation of 16 Japonica rice varieties with good agronomic characters. The high?quality Japonica rice varieties with strong anther culture ability were screened according to the callus induction rate and green plantlet differentiation rate. [Result] 17y155 was suitable to be used as the parent material of anther culture F1 generation， which has great application potential in the field of anther cultivation. [Conclusion] This research is of great importance to the establishment of anther cultivation efficient system and new high?quality rice lines.

Key words?Japonica rice;Anther culture;Culture ability;Genotype

隨著現代生物和農學技術的迅速發展，水稻花藥培養作為植物細胞工程的主體技術之一，已經在水稻遺傳育種上取得了突破性的進展[1]。自20世紀70年代以來，我國水稻花藥培養技術已經與傳統育種、轉基因、化學物理誘變等相結合，成為水稻育種領域一個卓越有效的技術手段[2]。水稻花藥培養技術在縮短育種周期、提高育種選擇效率、混倍體用于植物細胞遺傳等基礎性研究、獲得具有雙親優勢特性的可育遠緣雜種、提供豐富的染色體變異材料等方面具有的巨大優勢[3-5]。

影響水稻花藥培養效率的因素有很多，包括基因型、培養基成分、碳源、激素、接種時期、培養環境等，其中基因型是影響水稻花藥培養力的最重要因素[6-7]。不同基因型植株的花藥對培養力的反應不同，表現在愈傷組織誘導率、分化率、再生植株綠化率等。沈錦驊等[8]比對分析了各種類型的水稻材料，發現花藥培養力由強至弱依次為糯稻、粳稻、秈粳雜交稻、秈稻，且不同材料之間差異很大。何濤[9]研究表明，愈傷組織的誘導和綠苗分化之間相關性顯著，均由多基因控制的數量性狀。分別將控制花藥培養力和綠苗分化率的基因定位于1號染色體和10號染色體上。何平等[10]對110個DH（雙單倍體）系進行花藥培養力的QTL（數量性狀位點）分析，得到了5個與愈傷組織誘導有關的QTL，分別位于6、7、8、10、12號染色體上;以及2個與綠苗分化有關的QTL，分別位于1、9號染色體上。苗立新等[11]研究發現，水稻雜種F1的愈傷誘導率、綠苗分化率介于雙親之間且偏向母本;如果父本和母本的花藥培養力均較強，F1代的培養力也會較強。由此可見，篩選出花藥培養力強且農藝性狀優良的水稻品系對水稻育種效率的提高具有十分重要的意義。鑒于此，筆者利用水稻花藥培養技術，對16個農藝性狀優良的粳稻品種進行了花藥離體培養，根據其愈傷誘導率和綠苗分化率的不同，篩選出了花藥培養力強的優良粳稻品系，對水稻花藥培養高效體系的建立以及創制優良水稻新品系具有重要意義。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

粳稻雜交F1代材料均采自于安徽省農業科學院水稻研究所試驗田。16種粳稻組合包括稻花香/17y153、越光早熟/17y153、越光早熟/17y154、17y155/松5123、17y155/龍粳46、17y155/松粳22、17y155/龍粳16、17y155/綏化18、17y155/稻花香、17y155/東農425、17y155/龍澤6號、17y155/越光早熟、17y156/稻花香、17y156/越光早熟、越光早熟/17y191、稻花香/17y191。

1.2?田間取材與低溫處理

不同時期花藥的誘導率有顯著的差異。長期實踐發現，最佳的取穗時間為08：00—10：00，此時細胞處于旺盛分裂期。研究表明，處于單核靠邊期的花粉形成愈傷組織的能力最強。田間取穗可根據器官形態指標判斷花粉發育時期，具體表現為：穗包大而不破，劍葉葉枕距下葉葉枕一般為5～7 cm;潁殼顏色呈淺綠色，大小接近成熟的潁殼，硬度適中;花絲加花藥長度小于潁殼的1/2、大于1/3。采穗時保留2片葉子，盡量減少水分的散失。剝取的幼穗用75%乙醇棉球擦拭消毒后，再用濕潤的紗布包好，裝入塑料袋并扎緊把口，以防止水分蒸發。隨后將待接種幼穗放進8 ℃低溫中處理10 d[12-13]。

1.3?花藥接種

將幼穗以枝梗為單位分開，每15～20支為1束，浸入0.1%升汞中滅菌10 min，隨后在超凈工作臺上用無菌水沖洗5次，并去除上部過嫩的穗及下部過老的穗。用鑷子取出消毒好的幼穗，左手的食指和大拇指持小穗基梗，右手拿預先消毒好的剪刀剪掉1/2潁殼（不傷及花藥），取出花藥置于含有2，4-D（二氯苯氧乙酸）、NAA（萘乙酸）的N6培養基上，每個培養基接種50～60枚花藥。隨后對接種后的花藥進行黑暗培養，培養溫度為26～28 ℃，相對濕度為78%～80%[12，14-15]。

1.4?分化培養

當花藥在N6培養基中避光培養20～40 d后，花藥會由淡黃色變成褐色，花藥裂開并長出小水泡狀物質，當愈傷組織直徑發育至1～2 mm時為最佳的轉育時期，此時將愈傷組織轉移至附加IAA（吲哚乙酸）、KT（激動素）的MS培養基中進行分化培養，培養溫度為25 ℃，相對濕度為60%，2 000 lx光照培養12 h/d[12，16]。

1.5?壯苗培養

分化培養10 d左右，愈傷組織會出現綠色斑點并逐漸長成綠芽、生根，長成綠苗，當高度至2～3 cm時，可利用附加IAA的懷特培養基進行壯苗培養。培養溫度為25 ℃，相對濕度為60%，2 000 lx光照培養12 h/d。當綠苗長至3～4片葉且出現白根時，向培養基表面加少量的無菌水，煉苗3～4 d，隨后移栽進行土培[12，17]。

1.6?數據統計方法

出愈率=愈傷組織塊數/接種花藥數×100%

綠苗分化率=分化綠苗愈傷組織塊數/轉移愈傷組織塊數×100%

綠苗產率=出愈率×綠苗分化率×100%[18]

2?結果與分析

2.1?水稻花藥培養情況

在培養初期，花粉沿著孢子體發育途徑，經多細胞花粉形成愈傷組織，此時愈傷組織在花藥內，為一團分生細胞組織，代謝旺盛且活力強（圖1A）。隨著愈傷組織的生長，早期出現的管狀分子形成維管組織，隨后逐漸形成厚角、厚壁等機械組織，成片集中分布，形成肉眼可見的愈傷組織（圖1B）。當愈傷組織轉移至分化培養基后，經過一段時間便開始根、芽原基的分化。水稻花粉愈傷組織分化根與芽的基礎是分生組織。表層分生組織某處活動形成芽原基，散生分生組織活動形成根原基，由根、芽基進一步發展成根芽（圖1C、D）。

2.2?不同水稻品系花藥培養力的比較

不同水稻品系的花藥培養力有顯著的差異。該研究結果顯示，粳稻組合17y155/龍澤6號組合表現出了較高的出愈率（24.76%）和綠苗分化率（25.07%）。同時，17y155/龍粳16、17y155/稻花香、17y155/松粳22、17y155/龍粳46都有較好的花藥培養力（表1）。由此可見，17y155適用為花藥培養F1代的親本，在水稻花藥培養領域有著很大的應用潛力。

3?結論與討論

基因型在水稻花藥培養中起到了至關重要的作用。提高水稻的花藥培養力，最根本的辦法是通過雜交等遺傳改良手段，把高培養力基因導入到優良親本或雜種中，通過改變基因型來提高材料的花藥離體培養能力。目前常用的方法就是在已有的優良農藝性狀的水稻品系中，篩選出有較高培養力的材料進行花藥培養。該研究發現，17y155是適合進行水稻花藥培養的優良品系。在后續的研究中，應不斷地發掘新的高培養力的水稻花培材料，從而更好地發揮花藥培養在育種中的優勢。

基因型雖然是影響水稻花藥培養力的關鍵因素，但培養條件同樣重要。培養基是組織培養中最重要的基質和支撐培養物，選擇合適的培養基對愈傷組織誘導和植株再生成功與否起著決定性作用。在水稻花藥培養中，N6培養基對粳稻材料培養效果較好;合5培養基對秈稻具有特殊的培養效果[19-20]。愈傷組織誘導形成后，一般采用MS基本培養基;綠苗形成后，通常采用懷特培養基對再生植物進行壯苗[21]。雖然培養基種類繁多，但由于組織培養對基因型的依賴性，目前還沒有一種花藥培養基被普遍使用。

激素是植物在某特定部位形成的微量物質，不但對誘導植物花粉粒細胞分裂、生長及分化起到十分重要的作用，而且對植物組織培養成功與否也起到關鍵作用[22]。植物激素一般包括生長素和細胞分裂素2大類，包括2，4-D、IAA、KT等。這兩類物質是培養基中的關鍵成分，其組成和配比不但可以影響花粉粒誘導形成愈傷組織，而且對愈傷組織形成來源也起到重要調控作用[23]。此外，許多研究發現，添加各種附加物對許多植物細胞和花藥組織培養有提高愈傷組織誘導率和再生植株的作用，其中常見的附件物有脯氨酸、活性肽、水解絡蛋白、丙氨酸、馬鈴薯提取液、椰子汁等，它們對提高水稻培養力也有較明顯的促進作用[24-26]。

花藥培養技術是目前創造純合基因型和培養豐富變異材料的最有效手段，篩選培養力強的優良水稻品系、加強花藥培養中關鍵技術和遺傳機理的研究、使花藥培養與基因工程技術相結合、減輕對基因型的依賴性將為水稻花藥培養的應用開創新局面。

48卷1期甘 泉等?基因型對粳稻花藥培養效率的影響

參考文獻

[1] 王淑珍，姚堅.水稻花培育種的實踐與探索[J].上海農業科技，2005（4）：16-17.

[2] 陳銀全，沈漢清，柯昉.水稻花培育種研究及新進展[J].福建省農科院學報，1997，12（2）：6-10.

[3] 張安中，向躍武，張志雄，等.花藥培養在水稻秈粳交恢復系選育上的應用[J].作物學報，1994，20（6）：758-761.

[4] 姜健，金成海，侯春香，等.水稻花藥培養研究與應用進展[J].中國農學通報，2001，17（4）：49-52.

[5] 李艷萍.水稻花藥培養與花培育種研究[J].天津農業科學，2003，9（4）：36-39.

[6] 吳丹，姚棟萍，李鶯歌，等.水稻花藥培養技術及其育種應用的研究進展[J].湖南農業科學，2015（2）：139-142.

[7] 王柏秋，李鑫，苗立新，等.花藥培養技術及其在北方粳稻育種中的應用與探討[J].北方水稻，2018，48（2）：34-39.

[8] 沈錦驊，李梅芳，陳銀全，等.花藥培養在水稻品種改良上的應用[J].中國農業科學，1982（2）：15-19.

[9] 何濤.影響秈稻花藥培養的因素及高培養力材料的篩選[D].成都：四川大學，2006：6-7.

[10] 何平，沈利爽，陸朝福，等.水稻花藥培養力的遺傳分析及基因定位[J].遺傳學報，1998，25（4）：337-344.

[11] 苗立新，李鑫，謝麗霞，等.提高水稻花培育種效率研究[J].北方水稻，2010，40（1）：15-17，37.

[12] 郭震華.寒地水稻花培技術研究及其在育種中的應用[J].北方水稻，2016，46（6）：9-10，15.

[13] 王伍梅，臺德衛，張效忠，等.水稻高效花藥培養技術體系的構建[J].中國農學通報，2009，25（16）：65-68.

[14] 陳紅，秦瑞珍.水稻花藥培養過程中各種影響因子的研究進展[J].中國農業科技導報，2007，9（3）：52-56.

[15] 孫杰，馬凌霄.水稻花藥培養適宜條件的相關研究[J].北方水稻，2017，47（1）：35-37.

[16] 張躍非，李碧如.溫度在水稻花藥培養過程中的影響研究[J].吉林農業，2010（11）：68，76.

[17] 賀梅，宋冬明，張麗萍，等.水稻花藥培養中常見問題及防治措施[J].北方水稻，2010，40（5）：50-51.

[18] 張躍非，王金玲，鄧曉容.高溫熱擊處理對培養水稻花藥愈傷組織形成的影響[J].綿陽師范學院學報，2010，29（11）：81-84.

[19] 馮雙華，李達模，賈凌輝，等.影響秈稻花藥培養誘導率作用的幾種因素[J].農業現代化研究，1995，16（5）：317-320.

[20] 何平，陳英，沈利爽，等.水稻花粉愈傷組織誘導能力的遺傳[J].科學通報，1997，42（8）：866-868.

[21] 朱永生，陳葆棠，張端品.提高水稻秈粳雜交后代花藥培養力的研究[J].華中農業大學學報，2001，20（4）：314-317.

[22] 董合忠，焦改麗，陳志賢.2，4-D、KT對棉花愈傷組織的誘導和體細胞胚胎發生的影響[J].華北農學報，1993，8（3）：87-91.

[23] LAKSHMANAN P，GEIJSKES R J，WANG L，et al.Developmental and hormonal regulation of direct shoot organogenesis and somatic embryogenesis in sugarcane（Saccharum spp.interspecific hybrids）leaf culture[J].Plant cell reports，2006，25（10）：1007-1015.

[24] 向發云，宋志紅，曾祥國，等.外源脯氨酸及水分脅迫對秈稻花藥培養效率的影響[J].湖北農業科學，2007，46（6）：861-863.

[25] 肖國櫻.水稻花藥培養研究綜述[J].雜交水稻，1992（2）：44-46.

[26] 田親親.水稻高抗性淀粉花藥培養技術體系的建立與優化研究[D].南京：南京師范大學，2014：4-7.