SPI凝膠顆粒制備及其Pickering高內相乳液特性研究

江連洲 溫家煜 王禹涵 羅小雪 姜思岐 隋曉楠

(東北農業大學食品學院， 哈爾濱 150030)

0 引言

Pickering高內相乳液是一種利用水和油部分潤濕的固體顆粒充當穩定劑、內相體積分數在74%以上的乳液。與傳統的通過大量小分子表面活性劑穩定的高內相乳液相比，通過固體顆粒穩定的Pickering高內相乳液具有乳化劑用量少、穩定性好、生物相容性好、可塑性強等優勢[1]。高內相乳液具有內相比例大、穩定性極佳、模版材料空隙均勻等特性，目前已被應用于食品藥品加工[2]、生物組織工程[3]、化妝品[4]等多種領域中。Pickering高內相乳液的顆粒穩定劑包括改性二氧化硅[5]、二氧化鈦凝膠顆粒[6]、羥磷灰石[7]、吐溫80[8]和微凝膠顆粒[9]等，這些無機材料和化學合成的顆粒在生物安全性、生物相容性和生物降解性等方面具有毒性風險，極大地限制了Pickering高內相乳液在食品醫藥領域的應用。

大豆分離蛋白(Soy protein isolate, SPI)中蛋白質質量分數在90%以上，氨基酸種類有近20種，并含有人體所必需的氨基酸，具有凝膠性、吸水性、乳化性、起泡性等多種功能性質[10]。在受熱時，由于球蛋白自身結構的改變，使埋藏在蛋白分子內的疏水基團暴露出來，可以形成自組裝的凝膠顆粒聚集體。由于SPI凝膠顆粒具有親水親油性，已被廣泛用作各種乳液的穩定劑[11]。

近年來，隨著人們對低反式脂肪酸食品的關注，有關采用天然材料穩定的Pickering高內相乳液方面的研究迅速增多。文獻[2]研究發現，小麥淀粉穩定的高內相乳液在成為蛋黃醬替代物方面有巨大潛力。文獻[12]使用乳清蛋白微凝膠制備的高內相乳液在4℃下儲存6個月仍能顯示出優異的穩定性，但該研究使用的顆粒需要進行化學改性，以提升界面穩定性。文獻[13]用己烷作內相，成功制備了由麥醇溶蛋白-殼聚糖復合顆粒作為穩定劑、內相體積分數可高達90%的高內相乳液。此外，許多研究發現，一些食品級顆粒可以成功制備Pickering高內相乳液，如乳清蛋白微凝膠[14]、纖維素凝膠顆粒[15]、淀粉凝膠晶體[16]和花生蛋白微凝膠顆粒[17]等，但這些穩定劑大多需要酸化、糖基化等復雜且費時的修飾，或在制備過程中仍需使用一些有機溶劑(如丙酮等)。因此，繁瑣的制備過程和化學材料的殘留等問題仍限制了Pickering高內相乳液在食品行業中的應用。

本文主要研究SPI凝膠顆粒在制備Pickering高內相乳液中的作用，以期為食品工業提供一種制備方法更便捷、材料更安全的穩定劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆粉，哈爾濱高新技術有限公司；葵花籽油 (市售)；正己烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、鄰苯二甲醛(OPA)、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、去離子水等，北京新光化工試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

CJJ-6型磁力攪拌器，上海儀電科學儀器股份有限公司；GL-25MS型高速冷凍離心機，寧波Scientz生物技術有限公司；PHS-25型數顯臺式酸度計，上海雷磁公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；Scientz-18N型冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；2500C型高速研磨機，永康市艾澤拉電器有限公司；T10-Ultra Turrax型均質器，德國IKA公司；NANO ZS90型粒度與電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；F-4500型熒光分光光度計，日本日立公司；BX53型科研正置光學顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司；Quorum PP310T型低溫冷凍系統、Hitachi-S-3400N型掃描電子顯微鏡，荷蘭皇家飛利浦公司；MCR302型流變儀，奧地利安東帕公司。

1.3 方法

1.3.1SPI的制備

參照文獻[18]的制備方法。將大豆粉首先在45℃溶于正己烷(液料比3 mL/g)脫脂2 h。將脫脂的大豆粉晾干后溶于去離子水中(液料比15 mL/g)萃取2 h，用1 mol/L NaOH將pH值調節至8.5并攪拌2 h。然后將混合物在9 000g、4℃下離心20 min以除去不溶物，并用1 mol/L HCl將上清液pH 值調節至4.5后靜置30 min，然后將上清液在6 000g、4℃下離心20 min。收集沉淀物，隨后用0.1 mol/L HCl將pH值調節至7.0。將沉淀物冷凍干燥后，獲得干基蛋白質質量分數為90.2%的大豆分離蛋白。

1.3.2SPI凝膠顆粒的制備

將冷凍干燥的SPI粉末溶解于去離子水(液料比20 mL/g)中，并攪拌2 h。然后將懸浮液在4℃下儲存12 h，以使蛋白質完全水化。使用0.01 mol/L HCl或NaOH將懸浮液的pH值調節至7.0，并在80℃的水浴中緩慢攪拌30 min。然后將懸浮液自然冷卻至室溫(20℃)即形成由SPI自組裝的凝膠顆粒凝膠。用T10-Ultra Turrax型均質器以10 000 r/min的速度破碎凝膠3 min，使凝膠顆粒分散得更加均勻。

1.3.3SPI凝膠顆粒的粒徑和ζ-電位

利用NANO ZS90型粒度與電位分析儀對所有樣品進行粒徑分布和ζ-電位測定，參照文獻[19]的方法稍加修改。為了研究pH值(3.0～10.0)對SPI凝膠顆粒的粒徑和ζ-電位的影響，并避免多個凝膠顆粒的相聚集影響測量，將樣品用不同pH值的 0.01 mol/L 緩沖溶液稀釋100倍后測量粒徑，稀釋1 000倍后測量電位。

1.3.4SPI凝膠顆粒表面疏水性分析

表面疏水性指數H0根據文獻[20]的方法稍加修改，使用ANS熒光探針測定蛋白質的表面疏水性。將不同pH值的SPI凝膠顆粒用 0.01 mol/L 磷酸緩沖溶液稀釋樣品，使最終質量濃度為0.04～0.2 mg/mL；同時使用pH值7.0的磷酸緩沖溶液配制ANS儲備液(8.0 mmol/L)。取4 mL各稀釋樣品加入15 μL ANS溶液，振蕩混合均勻后靜置10 min，使用熒光光度計在激發波長為370 nm、發射波長為470 nm下測量混合物的熒光強度。以熒光強度對蛋白質質量濃度(mg/mL)的初始斜率(通過線性回歸分析計算)制圖用作表面疏水性指數計算。

1.3.5SPI凝膠顆粒微觀結構觀察

參照文獻[21]的方法并稍作修改。使用Hitachi-S-3400N型掃描電子顯微鏡對SPI凝膠顆粒進行微觀觀察。將一滴SPI凝膠顆粒樣品置于載物臺上，并用液氮冷凍。隨后在真空條件下，將樣品轉移至-160℃的制備室(Quorum PP310T型低溫冷凍電鏡制備系統)中，并用刀片橫切樣品。然后將樣品在-100℃下升華15 min。最后，將樣品表面噴涂上金，并轉移至掃描電子顯微鏡的冷凍室內拍攝圖像，冷凍室溫度控制在-140℃。

1.3.6Pickering高內相乳液的制備

將新鮮制備的SPI凝膠顆粒分散在去離子水中，使分散液中蛋白質質量分數為1.00%。通過滴加0.01 mol/L HCl或NaOH將分散液的pH值分別調節至4.5、7.0和9.0。然后使用T10-Ultra Turrax型均質器以10 000 r/min對SPI凝膠顆粒分散液均質1 min。

為了研究乳液形成時的內相體積分數對乳液結構的影響，在上述SPI凝膠顆粒分散液中滴加體積分數為10%、30%、50%、70%、78%、80%、82%的葵花籽油，用T10-Ultra Turrax型均質器于6 000 r/min均質2 min，形成乳液，當內相體積分數大于74%時，形成Pickering高內相乳液。

1.3.7Pickering高內相乳液微觀觀察

使用光學顯微鏡觀察乳液的微觀結構。將一滴乳液和Pickering高內相乳液放入顯微鏡載玻片上，小心地使用蓋玻片固定并確保內部沒有氣泡。圖像以40倍放大率拍攝。

參照文獻[19]的方法并稍作修改。使用冷凍掃描電子顯微鏡對Pickering高內相乳液進行觀察。將一滴乳液樣品置于載物臺上，并用液氮冷凍。隨后在真空條件下，將樣品轉移至-95℃的制備室中，并用刀片橫切樣品。然后將樣品在-100℃下升華15 min。最后，將樣品表面噴涂上金，并轉移至掃描電子顯微鏡的冷凍室內拍攝圖像，冷凍室溫度控制在-170℃。

1.3.8Pickering高內相乳液流變測量

參照文獻[2]的方法，使用旋轉黏度計測量乳液的流變行為，在25℃下椎板之間的間隙設置為0.80 mm。在掃頻模式下，設定恒定應變為0.5%，在0.1～10 Hz頻率下測量Pickering高內相乳液的彈性模量和黏性模量。

1.4 數據統計分析

所有測量至少進行3次，結果表示為平均值±標準差。利用SPSS Statistics 24軟件對數據進行ANOVA和Duncan檢驗(p<0.05)統計分析。

2 結果與分析

2.1 SPI凝膠顆粒粒徑分析

如圖1所示，在pH值為4.0和5.0時，0.01%的SPI凝膠顆粒分散液為不穩定的懸浮液，形成了肉眼可見的聚集體，所以不能通過NANO ZS90型粒度與電位分析儀準確測量該pH值條件下SPI凝膠顆粒的平均粒徑，測得其聚集體的粒徑為3 443.0～4 502.0 nm。SPI凝膠顆粒平均粒徑隨pH值的變化差異顯著(p<0.05)。當pH值為3.0時，平均粒徑為258.6 nm。當pH值在6.0～10.0時，SPI凝膠顆粒粒徑依次為170.7、248.8、268.5、302.7、305.2 nm，呈逐漸升高趨勢，但整體變化并不明顯。該粒徑范圍與其他作為高內相乳液穩定劑的蛋白顆粒大小研究結果相似，如文獻[22]發現明膠顆粒的平均粒徑為235.9 nm，文獻[17]發現花生蛋白顆粒的粒徑為40～150 nm。在堿性條件下，SPI凝膠顆粒粒徑較大。因為該顆粒是一種微凝膠顆粒，具有一定程度的吸水和溶脹能力[23]，所以粒徑的輕微增加應為SPI顆粒的吸水性引起的，而非顆粒間聚集。本試驗中的SPI凝膠顆粒平均粒徑大于文獻[24]報道的大豆蛋白凝膠的流體動力學直徑(141.0～158.0 nm)。該差異是由于本試驗制備SPI凝膠顆粒時蛋白質質量分數(5%)較高，是文獻[24]的2倍。蛋白質濃度對熱誘導蛋白質聚集產生自組裝凝膠顆粒有著重要影響[25]。在較低的蛋白質濃度下，球狀蛋白質之間的熱誘導相互作用往往發生在分子內而不是分子間。隨著蛋白質濃度的增加，SPI形成分子間相互作用，并最終形成蛋白質凝膠。所以蛋白濃度對其形成的熱凝膠顆粒粒徑存在一定影響。

圖1 不同pH值條件下的0.01%大豆分離蛋白凝膠顆粒懸浮液Fig.1 0.01% soybean protein isolate gel particle suspension at different pH values

2.2 SPI凝膠顆粒ζ-電位分析

SPI凝膠顆粒ζ-電位隨pH值變化。在pH值低于5.0時觀察到SPI凝膠顆粒呈現正電性(pH值為3.0時ζ-電位為22.32 mV，pH值為4.0時ζ-電位為9.33 mV)，這是因為SPI顆粒表面引入帶正電的氨基。當pH值超過5.0時，由于羧基的去質子作用，SPI凝膠顆粒趨于帶負電，在pH值為5.0～10.0時，ζ-電位依次為-3.17、-20.00、-28.25、-24.20、-26.94、-30.83 mV，在pH值為7.0～10.0時變化并不明顯。本研究中觀察到SPI凝膠顆粒的ζ-電位隨pH值變化的趨勢與文獻[26]的結果相似。SPI凝膠顆粒對pH值變化非常敏感，當ζ-電位絕對值較小時, 凝膠顆粒表面所帶的同性電荷較少,減小了靜電排斥作用。進而降低了分散液穩定性,使體系中蛋白分子傾向于相互聚集，這與圖1和粒徑變化中觀察到的結果一致。當SPI凝膠顆粒的ζ-電位趨近于零時，pH值約為4.5，與 SPI的等電點(pH值為4.5)相近，因此SPI凝膠顆粒的制備工藝對SPI的等電點幾乎沒有影響。當pH值大于5.0時，SPI凝膠顆粒ζ-電位的絕對值逐漸增大，并在堿性條件下逐漸趨于穩定。因為在堿性條件下SPI凝膠顆粒表面同性電荷增多，同性電荷間的相互排斥使蛋白質溶液更穩定，減弱了蛋白顆粒分子間的相互作用，促進SPI凝膠顆粒作為Pickering高內相乳液的穩定劑。

2.3 SPI凝膠顆粒表面疏水性分析

蛋白質的表面疏水性指數H0是影響蛋白顆粒表面相關功能的重要參數。在pH值為3.0～6.0時，SPI顆粒表面疏水性指數很高,依次為15 762.00、16 768.40、10 183.00、4 409.80，H0在等電點附近(pH值為4.0～5.0時)出現最大值。由圖1和表面疏水性指數H0對比可知，SPI蛋白凝膠顆粒的表面疏水性與溶解度呈負相關。蛋白質的溶解度取決于蛋白質分子的親/疏水平衡, 這種平衡主要取決于暴露于蛋白質分子表面的氨基酸組成。在氨基酸側鏈殘基中,疏水性殘基通過疏水鍵于蛋白質分子中心相互結合, 形成疏水區域；而親水性殘基排列于能夠與水分子接觸的蛋白質分子外側, 形成親水區域[27]。當pH值從7.0增加到10.0時，SPI凝膠顆粒的疏水性維持在較低水平，H0依次為1 541.26、697.56、831.00、673.90，且pH值在8.0～10.0間SPI顆粒的表面疏水性指數相差較小，表明蛋白質傾向于折疊，這導致疏水殘基被掩埋，阻止了蛋白質顆粒疏水區的暴露，從而抑制了SPI凝膠顆粒的疏水性。文獻[28]研究發現，肉類蛋白熱凝膠顆粒在不同pH值下的疏水性趨勢與本文結果一致。文獻[29]的研究表明在中性pH值下SPI的表面疏水性指數為55.32。與其相比，本研究的SPI凝膠顆粒的H0明顯高于其他研究。其原因可能為熱處理誘導SPI折疊，導致更多疏水性基團遷移到分子外部。因此，疏水相互作用和電荷間排斥作用可能是蛋白質粒子排列形態不同的原因[30]。

2.4 SPI凝膠顆粒微觀結構分析

可通過冷凍掃描電子顯微鏡觀察SPI凝膠顆粒在不同pH值下的微觀結構。本研究選取3個具有代表性的pH值，即等電點(pH值為4.5)、中性點(pH值為7.0)和中等堿性點(pH值為9.0)進行pH值對SPI凝膠顆粒微觀結構影響的分析。如圖2所示，可以觀察到單個的SPI凝膠顆粒均具有球形外觀，直徑為70～250 nm。在不同的pH值條件下，SPI凝膠顆粒處于不同的聚集狀態。當pH值為4.5時，由于此時處于等電點， SPI凝膠顆粒間靜電斥力降低，具有較強的范德華力[21]，因此顆粒形成了較大的圓形聚集體。當pH值為7.0時，顆粒以條帶型相聯，形成一些橢圓形的聚集體。當pH值為9.0時，幾乎所有顆粒都被交聯且緊密融合在一起，形成較為均一的微凝膠網絡狀結構。SPI凝膠顆粒融合的凝膠網絡狀結構可以共同作用于水/油界面，對Pickering高內相乳液進行穩定。

圖2 大豆分離蛋白凝膠顆粒冷凍掃描電鏡圖像Fig.2 Cryo-scanning electron microscopy analysis of soybean protein isolate gel particles

2.5 Pickering高內相乳液外觀觀察

由圖3可以看出，不同pH值條件下得到的SPI凝膠顆粒制備的Pickering高內相乳液具有不同的狀態。當pH值為4.5和7.0時，乳液形成了聚集體或絮凝物，出現了明顯的相分離情況，表明在此pH值條件下無法制備出穩定、均一的高內相乳液。當pH值為9.0時，Pickering高內相乳液外觀均勻統一，結構細膩，呈乳白色，表明在堿性條件下制備的SPI凝膠顆粒更有利于穩定Pickering高內相乳液。

如圖4所示，為了進一步研究內相體積分數對形成乳液外觀穩定性與微觀結構的影響，在pH值為9.0 的條件下制備了蛋白質質量分數為1.00%、內相體積分數不同的Pickering乳液。當內相體積分數為10%～70%時，此時乳液不能被稱為高內相乳液。該乳液體系出現明顯的分層現象，并且隨著油相濃度的增加，上層乳白色絮狀層增厚。當內相體積分數不斷增加至82%時，形成了穩定的高內相乳液。其表面呈奶油狀，細膩均一，較為黏稠，流動性差，在常溫下放置14 d仍未出現相分離現象。

圖3 不同pH值的大豆分離蛋白凝膠顆粒穩定的Pickering高內相乳液Fig.3 High internal phase Pickering emulsions stabilized bysoybean protein isolate gel particles of different pH values

圖4 大豆分離蛋白凝膠顆粒穩定的不同內相體積分數的Pickering乳液Fig.4 Pickering emulsions with different internal phase volume fractions stabilized by soybean protein isolate gel particles

2.6 Pickering高內相乳液光學顯微鏡觀察

SPI凝膠顆粒穩定的Pickering 高內相乳液的40倍光學顯微鏡下微觀結構如圖5所示，由圖5可知，所有由pH值9.0的SPI凝膠顆粒穩定的高內相乳液微觀結構均呈現圓形液滴狀，液滴粒徑在5～50 μm之間，變化較大。當內相體積分數小于70%時，液滴隨機分散分布，隨著內相體積分數的增加，形成高內相乳液后，液滴處于更緊密的填充狀態，排列整齊，相互連接，形成一個致密的網絡狀油滴體系。隨著內相體積分數的增加，乳液的液滴尺寸逐漸減小，表明較高的內相體積分數有利于形成更穩定的凝膠狀結構，這與文獻[31]的試驗結果一致。

圖5 不同內相體積分數的Pickering乳液的光學顯微鏡圖像Fig.5 Observation of Pickering emulsion optical microscope with different internal phase volume fractions

圖6 Pickering高內相乳液的冷凍電鏡圖像Fig.6 Observation of Pickering high internal phase emulsion cryo-scanning electron microscope

2.7 Pickering高內相乳液冷凍電鏡觀察

如圖6所示，用冷凍電鏡對SPI凝膠顆粒穩定的Pickering高內相乳液進行了表征，有利于更清晰直觀地了解高內相乳液的微觀結構。所有的油滴都被包裹在由SPI凝膠顆粒構成的三維網狀結構中。SPI凝膠顆粒在油滴表面形成的緊密填充層為Pickering高內相乳液整體充當空間屏障，增強液滴間穩定性[32]。此外，SPI凝膠顆粒可以橋接相鄰液滴，從而形成自組裝結構，這也是Pickering乳液的特點之一[19]。隨著內相體積分數從78%增加到82%，油滴尺寸減小，且油滴間分布更加緊密。這一結果與光學顯微鏡觀察結果一致。

圖7 Pickering高內相乳液流變分析圖Fig.7 Rheological analysis diagram of Pickering high internal phase emulsions

2.8 Pickering高內相乳液流變分析

圖7a顯示了在內相體積分數為78%～82%、蛋白質質量分數為1.00%時，Pickering高內相乳液的靜態流變分析圖。隨著剪切速率的增大乳液黏度逐漸下降，表現出典型非牛頓假塑性行為。這是乳液間的弱締合相互作用所導致的，文獻[33]所報道的鈣離子誘導交聯的乳清蛋白納米顆粒穩定的高內相乳液也具有這種顯著的剪切稀化行為。此外，在相同的剪切速率下，Pickering高內相乳液的內相體積分數越高，表觀黏度越大。文獻[34]得到相似的結論，即隨著辛烯基琥珀酸酐淀粉濃度和分散相體積分數的增加，乳液的表觀黏度和假塑性特性都有所增加。圖7b顯示了在內相體積分數為78%～82%、蛋白質質量分數為1.00%時，Pickering高內相乳液的彈性模量和黏性模量的變化。隨著頻率的增加，Pickering 高內相乳液的彈性模量和黏性模量逐漸增大，并且彈性模量始終大于黏性模量，證實了SPI凝膠顆粒穩定的Pickering 高內相乳液具有彈性凝膠特征，并且彈性模量的變化與頻率變化無關。乳清蛋白、小麥醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白穩定的高內相乳液[35-36]都具有相似的彈性凝膠乳液特征。在同一頻率下，隨著內相體積分數的增大，彈性模量與黏性模量都逐漸增大。說明Pickering高內相乳液的流變性能受內相體積分數的影響，較高內相體積分數的油滴間具有更緊密的網絡狀結構，對形成剛性乳液有一定的作用。

3 結論

(1)以pH值為9.0的大豆分離蛋白凝膠顆粒作為Pickering高內相乳液穩定劑，制備了無表面活性劑的食品級Pickering高內相乳液，其內相體積分數可達到82%。

(2)pH值對大豆分離蛋白凝膠顆粒具有顯著的影響。在堿性條件下，SPI凝膠顆粒平均粒徑較大，約為300 nm，ζ-電位絕對值最大，顆粒相互交聯且緊密融合，形成均勻的凝膠網絡狀結構。以此大豆分離蛋白凝膠顆粒制備出了穩定性較強的Pickering高內相乳液。

(3)對大豆分離蛋白凝膠顆粒穩定的不同內相體積分數的Pickering高內相乳液進行了宏觀與微觀觀察，發現隨著內相體積分數的增大，高內相乳液更為粘稠，形成更加細小致密的多孔結構，保證了乳液的機械穩定性。