不同均質次數SPI-維生素D3納米粒子結構與性質研究

王喜波 陳 爽 孫立娜 江連洲

(東北農業大學食品學院， 哈爾濱 150030)

0 引言

維生素D是人體必需的微量營養素，具有促進細胞生長、分化和對鈣、磷的吸收等重要作用，還與某些腫瘤、自身免疫性疾病等有關[1-2]。維生素D3是維生素D的7-位脫氫膽固醇(7-dehydroch-olesterol, pro-vitamin D)的一種結構形態，在人體內經不同羥基化后，代謝為1,25-二羥膽鈣化醇(維生素D3的生物活性形式)。維生素D是人體最易缺乏的維生素之一，且這種現象在全球范圍內普遍存在[3-4]。維生素D3水溶性差[5]，對光照敏感，氧、酸性條件，脂肪酸敗等都影響其穩定性，因此，維生素D3的利用受到限制。

大豆分離蛋白(Soy protein isolate，SPI)可以用作生物活性成分的輸送載體，但由于SPI的疏水基團絕大部分深埋在內部，且結構較緊密，所以與生物活性成分小分子的結合能力有限。文獻[6]研究發現，乳清蛋白的三級結構在適度加熱的條件下發生改變，結構更加延展，增強了與小分子物質間的相互作用。文獻[7]用超聲制備了粒徑分布窄小、具有緩釋功能的酪蛋白-β-胡蘿卜素納米顆粒，有效提高了β-胡蘿卜素的穩定性。高壓均質技術在食品、醫藥和化妝品等領域已被廣泛應用[8]，適當的高壓均質處理能顯著改善球蛋白的表面疏水性、溶解性、乳化性、柔性及抗氧化性等加工特性[9-11]。在食品行業，高壓均質主要應用于乳液制備方面，如文獻[12]采用高壓均質制備乳清蛋白乳液，發現高壓處理可以改變蛋白界面層的結構，同時改變乳液粒徑，增強蛋白質在界面上的吸附性和蛋白質在界面上的相互作用效果，從而有助于形成比較緊密的界面層和穩定性強的乳狀液。但采用高壓均質制備SPI-維生素D3納米粒子的研究卻鮮有報道，本文研究高壓均質次數對SPI-維生素D3納米粒子結構及性質的影響，以期為開發高活性維生素D3產品提供技術和理論支持。

3.5 病蟲害發生情況 避雨栽培的無核紅寶石10月25日葉片仍然完好，而露地栽培的葉緣已經干枯卷曲。采用避雨栽培后，病蟲害種類發生變化（見表4），灰霉病、霜霉病、黑痘病基本不發生，主要病害危害程度和鳥害危害程度都比露地栽培顯著減輕。避雨栽培后，噴藥次數比露地減少5次，大大減小了病蟲害防控壓力。避雨栽培后，裂果較露地有明顯減少，僅避雨一項措施，就可以將裂果率降到3%以下，如果再結合地膜覆蓋，避雨栽培就可以解決葡萄裂果問題。

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老巴慌成一團。他急不擇路地沖過去，蹲下身來扶老婆。慌亂中自己憑著一條腿怎么都站不起身。手臂下老婆的氣息越來越弱。老巴慌了，聲嘶力竭地叫喚，有如荒野中絕望的狼。隔壁左右聽到這聲音，嚇得不輕，都急急奔來。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器設備

維生素D3，純度99%以上，購自Sigma-Aldrich官網。低溫脫脂豆粕，購自山東禹王實業有限公司。甲醇，上海安譜試驗科技股份有限公司；1-苯胺基-8萘磺酸鹽(ANS)，天津北科化學品有限責任公司；試驗中所用試劑均為分析純。

AVP-2000型高壓均質機，英國Stansted Fluid Power公司；79-1型磁力加熱攪拌器，金壇市雙捷試驗儀器廠；FTIR-8400S型傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；Mastersizer 2000型激光粒徑分析儀，英國Malvern公司；U3000型高效液相色譜儀，美國Thermo公司。

1.2 試驗方法

4） 在工程應用中，由于礦化垃圾反應床露天作業、占地面積較大，且礦化垃圾本身又是很好的植物培養土，因此可以考慮在礦化床表面種植綠色植物，并引入蚯蚓、屎殼郎等動物，提高床體表面的復氧能力，通過日益完善的微生物、植物、動物復合生態系統，進一步提高對尾水的處理效果。

在燕園上班，給我帶來了很多的便利：第一，我每天上下班不用擠公共汽車，免除了途中勞頓；第二，我能領取一份穩定的薪水，解決生存沒有問題；第三，我可以利用北大資源好好學習，全面提高自己的學養。

為避免維生素D3降解，以下操作均在避光條件下進行。稱取一定維生素D3粉末溶于無水乙醇，并磁力攪拌以保證其完全溶于乙醇，置于棕色瓶中備用。每次試驗前需重新配制維生素D3溶液。

將文獻[13]描述的方法略做改動制備SPI，將SPI粉末溶于磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH值7.0)配制成4 mg/mL的SPI溶液，按照SPI與維生素D3質量比10∶1將維生素D3溶液加入到SPI溶液中，室溫(20℃)下避光磁力攪拌1 h以制備SPI-維生素D3復合體系，在100 MPa下均質1～4次，得到不同均質次數的SPI-維生素D3納米復合物。

1.2.2粒徑和ζ-電位測定

用0.01 mol/L pH值7.0磷酸鹽緩沖液將制備的不同均質次數的納米復合物稀釋至蛋白質量濃度為1 mg/mL，用Mastersizer 2000型納米粒徑儀檢測納米顆粒的粒徑、多分散性指數和ζ-電位，測定溫度為25℃，樣品平衡時間為2 min。

m1——加入維生素D3的質量，mg

準確稱取維生素D3標準品50 mg溶于甲醇并定容至50 mL，配制成1 mg/mL的維生素D3甲醇溶液，再用甲醇將其分別稀釋至質量濃度為0.5、0.25、0.01、0.001 mg/mL的標液，將各質量濃度的標液過0.22 μm有機系濾膜，采用高效液相色譜進樣分析，以各標液的質量濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。高效液相色譜分析參數參照文獻[14]的方法，高效液相色譜檢測器為紫外檢測器，波長為265 nm，所用色譜柱為C18液相柱，檢測時，柱溫為25℃，流動相為甲醇(100%)，流速為1 mL/min。

1.2.4維生素D3包封率和負載率測定

包封率和負載率的測定參照文獻[15]的方法并略做改動。將10 mg凍干樣品用5 mL甲醇進行淋洗，然后用Whatman No 1型濾紙過濾，重復2～4次，將濾液合并，然后將濾液過0.22 μm有機系濾膜后用高效液相色譜測定其中維生素D3含量(未結合維生素D3含量)，將過濾后的粉末凍干并稱量。樣品包封率和負載率計算公式為

內源熒光光譜測定參照文獻[17]的方法，并略做改動，將各樣品分別稀釋至蛋白質量濃度0.5 mg/mL，設定激發波長為290 nm，發射波長范圍為300～400 nm，狹縫寬度為2.5 nm，電壓700 mV，進行內源熒光光譜掃描。

(1)

(2)

式中E——包封率，%

L——負載率，%

雖然污水處理過程中的回流污泥泵正常運行，并且上清液也能夠全部回流，出水氨氮達標，但是總氮依然超標。因此，可以將缺氧攪拌全部設定為反硝化，這樣能夠很好地進行脫氮，并控制好出水總氮量，達到相關標準的要求。

1.2.3維生素D3標準曲線繪制

從業人員整體素質偏低，缺少優秀專業人員，是行業內的一大問題。在如今階段，除了央視廣播電視頻道能夠做到對信息的實時更新和傳播，大多數地方廣播電視臺受到節目播出時間、技術落后等各種因素影響，大部分新聞、資訊播出具有延時性。這樣就非常容易造成在信息反饋給大眾時，發現新聞播出，但是信息已發生變化的現象，這就使新聞報道失去了真正的意義。

寬甸縣年最低氣溫整體呈周期性變化，如圖3所示。2000、2001年為偏冷期；最高值出現在1995年，為-21.7℃，最低值出現在2001年，為-33.5℃，兩者相差11.8℃。2014—2017年為偏暖期。

m2——未與SPI結合的維生素D3質量，mg

m3——SPI質量，mg

1.2.1SPI-維生素D3納米復合物制備

制造能力是面向云制造的一種重要資源，體現在具體活動過程中，反映了制造企業或制造實體在制造全生命周期過程中完成某一任務的能力[8]。針對制造過程的可持續制造能力，Zhao等[9]建立了針對工業機器人的可持續制造能力動態模型；Luo等[10]提出了針對云制造系統的制造能力多維信息的建模與描述方法；Xu等[11]對制造設備能力相關的信息進行了動態建模；Kulvatunyou等[12]提出一種體現供應商制造服務能力的信息模型，并利用基于本體的Web語言提高模型敏捷度。

1.2.8傅里葉紅外光譜分析

參照文獻[14]的方法并稍做修改，將各樣品在紫外-可見分光光度計600 nm波長下測定其吸光度，所得OD值用來表示濁度，用去離子水作為空白。

1.2.6表面疏水性測定

參照文獻[16]的方法，并略做改動。用磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH值7.0)將樣品溶液稀釋到1、0.2、0.04、0.008 mg/mL，然后加入20 μL的ANS(8 mmol/L，溶于0.01 mol/L的磷酸緩沖液，pH值7.0)熒光探針，混合均勻后在室溫下進行避光處理，15 min后測定各樣品的熒光強度，設定激發波長為390 nm，發射波長為470 nm，狹縫寬度5 nm，以測得熒光強度為縱坐標，以蛋白溶液質量濃度為橫坐標，選擇線性關系良好的回歸線的斜率作為蛋白質表面疏水性指數。

1.2.7內源熒光光譜測定

還有“名著管理法”。每學期初，我要求學生每人至少準備一本名著，名人傳記、文學名著，或成功勵志書籍都行。我還布置閱讀名著的作業，讓學生每天利用課間或課外時間讀名著，每天閱讀時間不少于20分鐘；并且每單周抽出一節語文課作為“名著閱讀課”，專門讓學生自讀名著，每雙周抽出一節語文課進行“名著秀”，展示或表演讀名著的收獲，對表現好的予以獎勵。

1.2.5濁度測定

CT掃描顯示33例腫瘤邊緣存在清晰界限或局限的病變范圍，其中28例病灶周圍硬化明顯，軟組織未發生腫塊，5例骨皮質變薄但不存在骨膜反應。16例腫瘤邊緣模糊，無明顯界限，且周圍軟組織發現腫塊，存在骨膜反應，2例骨皮質遭到破壞甚至中斷，并且骨膜反應較為明顯。

將1 mg冷凍干燥后的樣品與150 mg KBr粉末混合研磨，然后將混合粉末壓制成固體薄片[18]，使用FTIR-8400S型紅外光譜儀進行全波段(4 000～400 cm-1)掃描，設置分辨率為4 cm-1，掃描次數為32次。采用PeakFit 4.12軟件進行擬合分析，通過酰胺Ⅰ區的反卷積算法計算不同蛋白樣品中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲成分的含量。

1.2.9SPI-維生素D3納米粒子的光穩定性

稱取4 mg維生素D3溶于10 mL去離子水中，取10 mL不同均質次數的樣品，分別置于直徑90 mm的培養皿中，按以上方法每個樣品制備9個，將其水平放置，用15 W的紫外燈近距離(20 cm)照射，每隔30 min取樣一次，每個樣品取出一個培養皿，每個培養皿取出0.5 mL樣品，測定其中維生素D3含量。

1.3 數據分析

所有試驗重復3次取平均值，采用SPSS 19.0進行數據處理和方差分析(ANOVA)，使用Origin 8.6軟件制圖，PeakFit 4.12軟件計算蛋白二級結構。所有結果均以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 納米粒子粒徑、多分散性指數和ζ-電位

如圖1所示，經過高壓均質處理后，SPI的平均粒徑顯著下降(P<0.05)，均在100 nm以下，平均粒徑由384.33 nm減小至84.77 nm(表1)，同時隨著均質次數的增加粒徑分布逐漸由雙峰分布轉變為單峰分布，粒徑分布更加均勻。樣品在經歷高壓均質的過程中，在一定的壓力下，流體被迫通過一些微米孔，流體在通過非常短的距離期間加速到非常高的速度，在經受空化、剪切和湍流等作用下，蛋白結構被破壞，其產生隨機破裂，解離或解聚，導致粒徑減小[19-21]。在高壓均質處理次數為1～4次的過程中，隨著均質次數的增加，樣品的平均粒徑逐漸減小，在均質次數為2次時，平均粒徑最小，為84.77 nm，當均質次數繼續增加時，平均粒徑和多分散性指數(PDI)均略有增大，但不顯著(P>0.05)。該結果可能由于樣品被高壓均質次數過多，反復經受物理作用，導致蛋白質重新聚合，粒徑增大[22]。

圖1 均質次數對SPI及SPI-維生素D3納米粒子粒徑分布的影響Fig.1 Effect of high pressures homogenization times on particle size distribution of SPI and SPI-VD3 nano-particles

SPI-維生素D3納米粒子在經歷0～4次高壓均質處理后，粒徑變化趨勢與SPI經受高壓均質后粒徑變化相同，平均粒徑由145.20 nm減小至82.00 nm。在經受相同次數的高壓均質條件下，SPI-維生素D3納米粒子與SPI相比有更小的粒徑，這也說明維生素D3與SPI相互作用后使復合物結合更加緊密。

由表1可知，SPI與SPI-維生素D3納米粒子均帶負電荷，有效的表面電荷主要決定懸浮顆粒的分散和聚集，更多的表面負電荷使顆粒之間的靜電排斥增強，可以使膠體聚集體破壞并防止進一步聚集[23-24]。樣品經受高壓均質處理后，電位的絕對值略有減小，當高壓均質3次和4次后，電位的絕對值顯著減小，該結果可歸因于蛋白變性和聚集的形成。

表1 均質次數對SPI-維生素D3納米粒子粒徑、PDI、ζ-電位的影響Tab.1 Effect of high pressure homogenization times on particle size, PDI, ζ-potential of SPI-VD3 nano-particles

2.2 納米粒子負載率和包封率

在SPI-維生素D3納米粒子制備過程中，許多參數都會影響SPI-維生素D3納米粒子的性質和負載率和包封率，表2中體現了均質次數對負載率和包封率的影響。未經高壓均質處理的SPI-維生素D3樣品的負載率為62.00%，包封率為6.20%，即維生素D3負載量可達到62.0 μg/mg，均質壓力為100 MPa、均質次數為2次時，負載率和包封率顯著提高，負載率達到79.21%，包封率達到7.92%，與未均質樣品相比提高了27.7%，這歸因于微通道中剪切、撞擊和空化等作用使SPI表面疏水性變化從而使更多的維生素D3可以和SPI疏水基團發生作用[25]。文獻[26]指出氫鍵和弱分子間作用力可以在均質作用下斷裂從而導致蛋白質分子結構的變化，暴露出更多疏水基團，與本試驗結果一致。當均質次數達到3次后包封率和負載率均有所下降。本團隊在之前的研究中發現SPI與維生素D3結合為非共價結合，主要作用力為疏水相互作用和靜電相互作用[27]，均質次數較多時，強的剪切、湍流等作用對已經結合的SPI-維生素D3的非共價鍵產生了破壞。在高壓均質過程中，一方面改變SPI的結構，提高其與維生素D3的相互作用，另一方面，過強的高壓均質破壞SPI與維生素D3之間的非共價鍵而不利二者結合。文獻[28]在研究高壓均質壓力對SPI-維生素D3納米復合物影響時得到了同樣的結論。

表2 均質次數對SPI-維生素D3納米粒子負載率和包封率的影響Tab.2 Effect of high pressure homogenization times on EE and LE of SPI-VD3 nano-particles %

2.3 納米粒子濁度

由圖2(圖中相同參數不同字母表示差異顯著，下同)可見，由于未均質的SPI樣品和SPI-維生素D3體系中存在大量沉積在底部的高分子聚合物，導致體系濁度較大；經過高壓均質的強剪切力和空化的作用力后，大的蛋白聚集體分散成小的亞基，使溶液中小聚集體數量增多，進而使濁度減小，該結果也可能與蛋白的溶解度有關，高壓均質改變蛋白結構，增大其在水中的溶解性，從而使濁度減小。文獻[14]研究發現未被處理的SPI溶液呈現低溶解度、高濁度，經過超聲空化作用處理后蛋白溶解性顯著提高，濁度降低。當均質3、4次時，濁度不再減小，反而略有提高，這可能是因為解離的小分子重新聚集。

圖2 均質次數對SPI-維生素D3納米粒子濁度的影響Fig.2 Effect of high pressure homogenization times on turbidity of SPI-VD3 nano-particles

2.4 納米粒子表面疏水性

圖3顯示了SPI與SPI-維生素D3納米粒子經過不同次數高壓均質處理后的表面疏水性的變化。均質0～3次時，SPI的表面疏水性指數顯著提高(P<0.05)，由1 134.8增大到1 537.2。該現象主要是由于高壓均質可以對蛋白的大聚集體進行破壞，使蛋白結構更加伸展，深埋在內部的疏水基團暴露于外部[29]。SPI-維生素D3的表面疏水性指數也隨高壓均質次數增大呈現出增大的趨勢，但其表面疏水性指數均低于單純的SPI，該結果可能因為維生素D3與蛋白疏水基團相互作用使表面疏水性降低，文獻[30]研究維生素D3與β-乳球蛋白相互作用時指出維生素D3可能通過蛋白表面的疏水基團與其結合。適當的均質次數可以有效地增大樣品的表面疏水性，而次數過多可能會使已經打開的蛋白結構重新聚合，由圖3可知，當均質次數為3次和4次時，高壓均質已經不再顯著改善表面疏水性，反而可能對蛋白產生了不利的影響。蛋白質-生物活性成分納米復合物是基于蛋白質與(難溶)生物活性物質之間的疏水相互作用而構建的納米輸送載體，疏水作用是一種熵驅動的自發過程，活性物質與蛋白的疏水位點接觸的可能性是兩者相互作用發生的關鍵，本試驗采用高壓均質法改變蛋白表面疏水性進而提高負載量。

圖3 均質次數對SPI-維生素D3納米粒子表面疏水性指數的影響Fig.3 Effect of high pressure homogenization times on surface hydrophobicity of SPI-VD3 nano-particles

2.5 納米粒子內源熒光光譜

固定激發波長290 nm，掃描不同均質次數處理后樣品的內源熒光光譜。從圖4可以看出，與未經高壓均質處理的樣品相比，樣品經高壓處理后，熒光強度明顯增強，更多的色氨酸殘基被暴露。熒光強度與均質次數不完全呈正相關關系，高壓均質使熒光強度增強，而維生素D3的存在可能使蛋白結構改變，發色基團色氨酸的微環境發生變化，進而改變其對熒光的敏感程度，使熒光強度降低。當內部色氨酸被其他構象遮蔽時也會使蛋白熒光發生猝滅[31]。

圖4 均質次數對SPI-維生素D3納米粒子內源熒光光譜的影響Fig.4 Effect of high pressure homogenization times on surface fluorescence spectroscopy of SPI-VD3 nano-particles

2.6 納米粒子傅里葉紅外光譜

圖5 均質次數對SPI-維生素D3納米粒子傅里葉紅外光譜的影響Fig.5 Effect of high pressure homogenization times on surface Fourier infrared spectroscopy of SPI-VD3 nano-particles

表3 不同均質次數下SPI-維生素D3納米粒子中蛋白二級結構相對含量Tab.3 Effect of high pressure homogenization times on protein secondary structure in SPI-VD3 nano-particles %

2.7 納米粒子光穩定性

文獻[36]提出維生素D3的光穩定性較差，維生素D3及不同高壓均質壓力下制備的各SPI-維生素D3納米粒子被放置于15 W的紫外燈下照射，各樣品中維生素D3的降解情況如圖6所示。維生素D3在水中降解較快，在紫外燈下照射4 h后，僅剩余18%，而與SPI發生相互作用后，維生素D3的光穩定性明顯提高，這可能因為大豆蛋白中的芳香族羥基和雙鍵可吸收紫外線，從而降低紫外線強度，達到保護維生素D3的作用[37]。均質壓力為0 MPa時樣

品在4 h紫外照射后維生素D3剩余24%，隨著均質次數的增多，樣品的光穩定性進一步提高，當均質次數為2次時，維生素D3質量分數提高到48%，與未均質樣品相比提高了166.6%，SPI-維生素D3納米粒子的光穩定性得到改善。該結果表明適當的高壓均質能促進SPI與維生素D3的結合，達到更好保護維生素D3的作用。

圖6 均質次數對SPI-維生素D3納米粒子光穩定性的影響Fig.6 Effect of high pressure homogenization times on light stability of SPI-VD3 nano-particles

3 結束語

適當的高壓處理能夠提高SPI-維生素D3納米粒子的性質。當高壓均質壓力為100 MPa、高壓均質次數為2次時，制備的SPI-維生素D3納米粒子的平均粒徑由145.20 nm減小至82.00 nm，濁度減小，體系更均一；包封率和負載率較高，分別為79.21%和7.92%，負載率提高了27.7%；SPI及SPI-維生素D3納米粒子的表面疏水性均增大，有利于SPI與維生素D3的結合；內源熒光光譜和傅里葉紅外光譜表明，高壓均質使復合物的結構發生變化，α-螺旋和β-折疊逐漸轉變成β-轉角；高壓均質處理使SPI-維生素D3納米粒子的光穩定性顯著提高，與純維生素D3相比，紫外燈下照射4 h后維生素D3的質量分數由18%提高至48%，提高了166.6%。本文認為，SPI-維生素D3納米粒子負載率的提高及光穩定性的改善與SPI結構展開、疏水基團暴露有一定關聯。