NanoSe-LMH-CS-SA復(fù)合載藥微球的制備與緩釋性能研究

吳永軍，吉 民，劉 燕，劉紅梅

1馬鞍山師范高等專科學(xué)校 食品工程系，馬鞍山 243041；2馬鞍山豐原制藥有限公司，馬鞍山 243000

現(xiàn)有補(bǔ)硒制劑主要采用無(wú)機(jī)硒、有機(jī)硒作為硒源，存在毒性較大，吸收利用率低等一系列弊端，限制了補(bǔ)硒制劑的臨床與日常應(yīng)用[1]。相比而言，納米硒(NanoSe)易于吸收利用，是己知硒制品中安全性最高的，無(wú)疑是補(bǔ)硒的最佳硒源[2]。

殼聚糖(chitosan，CS)是一種無(wú)毒的天然高分子多糖，其生物相容性好，無(wú)致突與致敏性，具有促進(jìn)組織再生、調(diào)節(jié)免疫、降血壓、降血脂及排毒等重要生理功能。殼聚糖作為一種聚陽(yáng)離子電解質(zhì)，結(jié)構(gòu)上含有大量氨基，在酸性消化液中能膨脹成粘稠的膠體物質(zhì)，有效阻滯包埋藥物的溶出與擴(kuò)散，在緩(控)釋藥物載體、靶向藥物載體、骨架劑、成膜劑等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用[3]。

海藻酸鈉(sodium alginate，SA)是一種具有生物相容性、可降解的天然聚陰離子多糖，被廣泛應(yīng)用于緩釋制劑的開(kāi)發(fā)中。當(dāng)殼聚糖與海藻酸鈉混合時(shí)，殼聚糖分子鏈上的大量氨基與海藻酸鈉的分子鏈上的大量羧基通過(guò)靜電引力聚集成電解質(zhì)膜，可有效包裹芯材、增強(qiáng)微球的穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)藥物釋放速度[4]。海藻酸是難溶性弱酸，沉淀pH值為3.6以下，溶解pH值為5.8，所以在進(jìn)行微膠囊化過(guò)程中要調(diào)節(jié)混合液的pH值。

賴氨酸是谷物中的第一限制性氨基酸，以稻谷小麥為主食的膳食結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致我國(guó)居民賴氨酸攝入量不足，引發(fā)機(jī)體蛋白質(zhì)代謝障礙，進(jìn)而出現(xiàn)一系列生長(zhǎng)發(fā)育問(wèn)題[5]。L-鹽酸賴氨酸(L-lysinemonohydrochloride，LMH)易溶于水，且屬于GRAS物質(zhì)，可用于人體日常補(bǔ)充賴氨酸。

納米藥物(制劑)是以微納米級(jí)高分子材料為壁材，以一定包埋方式負(fù)載納米級(jí)藥物芯材，制成具備微球、微囊、膠束等特殊結(jié)構(gòu)的新型藥物(制劑)；其具有緩控釋放、靶向增濃、提高藥物生物相容性及吸收利用率等突出優(yōu)勢(shì)[6,7]。本研究以帶有相反電荷的殼聚糖、海藻酸鈉作為壁材，吸附包裹NanoSe芯材，添加LMH作為復(fù)合營(yíng)養(yǎng)物，CaCl2做交聯(lián)劑，使用復(fù)凝聚法制備了NanoSe-LMH-CS-SA復(fù)合載藥微球(簡(jiǎn)稱復(fù)合載藥微球)；實(shí)驗(yàn)測(cè)試了壁材比、芯壁比、交聯(lián)溫度、交聯(lián)劑用量對(duì)包埋率的影響，進(jìn)而通過(guò)BBD設(shè)計(jì)優(yōu)化微球制備工藝條件；借助體外釋放實(shí)驗(yàn)測(cè)試了復(fù)合載藥微球在兩種不同模擬消化液中的硒釋放率，以期為緩釋型補(bǔ)硒制劑的研究與開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖(BR，脫乙酰度>85%，美國(guó)Sigma試劑公司)；海藻酸鈉(AR，成都西亞化工股份有限公司)；LMH(BR)、CaCl2(AR)、CH3COOH(AR)、HCl(AR)、NaHCO3(AR)、NaOH(AR)、無(wú)水酒精(AR)(國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；KH2PO4(AR，天津博迪化工有限公司)；NanoSe溶膠(10.9 mg/mL，粒徑20～50 nm，pH=3.0±0.5，煙臺(tái)佳隆納米產(chǎn)業(yè)有限公司)；蒸餾水。

S-4800掃描電鏡(日本Hitachi)；LS-13-320激光粒度分析儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特)；Nicolet6700傅立葉紅外光譜儀(美國(guó)尼高力)；DTG-60H熱重-差熱分析儀(日本島津)；Vario EL III元素分析儀(德國(guó)元素分析系統(tǒng)公司)；TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析)；BPZ-6210-2B真空干燥箱(上海一恒)；DZTW-500型恒溫電熱套磁力攪拌器(上海力晨)；TS-110X50恒溫水浴搖床(上海天呈)；FA1104型分析天平(上海舜宇恒平)；TGL-16C型離心機(jī)(常州中捷)；PHS-3C電子pH計(jì)(上海雷磁)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)合載藥微球制備

以1.0%乙酸溶液100 mL先后溶解1 g殼聚糖及1g CaCl2，配制成的殼聚糖與CaCl2濃度均為10 mg/mL的混合溶液，記為A液；同時(shí)，以1.0%海藻酸鈉溶液(pH 5.8)100 mL溶解0.5 g LMH，配制5 mg/mL的LMH溶液，再以此LMH溶液稀釋定量NanoSe溶膠，1 000 rpm均質(zhì)10 min，記為B液。

用帶8號(hào)針頭的50 mL注射器吸取40 mL B液，自30 mm高度緩慢滴至10 mL A液中(每滴入20 mL B液調(diào)整一次滴加高度)，使用HCl、NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH=5.0，300 rpm轉(zhuǎn)速下40 ℃恒溫交聯(lián)60 min，離心分離沉淀，用蒸餾水清洗沉淀3遍，40 ℃真空干燥得到NanoSe-LMH-CS-SA復(fù)合載藥微球。

1.2.2 復(fù)合載藥微球結(jié)構(gòu)表征

NanoSe-LMH-CS-SA復(fù)合載藥微球的形貌使用SEM電鏡進(jìn)行檢測(cè)，微球粒徑分布使用激光粒度分析儀檢測(cè)，微球的有機(jī)結(jié)構(gòu)采用傅立葉紅外光譜儀分析，微球的熱效應(yīng)采用熱重-差熱分析儀分析。檢測(cè)條件如下。

1.2.2.1 形貌檢測(cè)

SEM采用Hitachi S4800型掃描電鏡，復(fù)合載藥微球樣品用酒精分散滴于銅片上并經(jīng)噴金處理，二次電子檢測(cè)器成像，加速電壓5 kV，工作距離9 mm，對(duì)應(yīng)放大倍率為22 000倍；工作距離9.1 mm，對(duì)應(yīng)放大倍率為40 000倍。

載藥微球粒度分布檢測(cè)采用貝克曼庫(kù)爾特LS-13-320激光粒度分析儀，檢測(cè)條件為：固體激光器功率5 mW，檢測(cè)波長(zhǎng)780 nm，濕法檢測(cè)、SOP模式，紅光折射率1.82，吸收率0.1。

1.2.2.2 紅外光譜檢測(cè)

紅外光譜分析采用美國(guó)尼高力Nicolet6700傅立葉紅外光譜儀，檢測(cè)條件為：光譜范圍4 000～500 cm-1，光譜分辨率0.8 cm-1，噪音峰-峰值1×10-5Abs，KBr壓片。

1.2.2.3 熱穩(wěn)定性檢測(cè)

微球熱穩(wěn)定性分析采用日本島津DTG-60H熱重-差熱分析儀，檢測(cè)條件為：N2氛，氣體流速30 mL/min，升溫速率10 ℃/min。

1.2.2.4 元素組成分析

C、H、N元素分析使用Vario EL III元素分析儀，檢測(cè)條件為：高純O2壓力0.20 MPa、流速10 mL /min，高純He壓力0.12 MPa、流速200 mL/min；燃燒爐溫度1 150 ℃，還原爐溫度850 ℃，樣品以錫紙包裹進(jìn)樣。Se元素含量檢測(cè)使用鄰苯二胺紫外分光光度法[8]，平行測(cè)定三次取均值。

1.2.3 體外釋放單因素實(shí)驗(yàn)

自配硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用鄰苯二胺紫外分光光度法于335 nm波長(zhǎng)下測(cè)硒標(biāo)液樣品吸光度A，以未加入復(fù)合載藥微球模擬消化液為空白對(duì)照，繪制硒標(biāo)準(zhǔn)曲線[2]。

準(zhǔn)確移取復(fù)合載藥微球微球10 mg至筒狀透析袋內(nèi)，用透析夾固定兩端浸于100 mL 2種不同pH值模擬消化液中，以HCl溶液(pH=1.0)作為模擬胃液，以磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.8)作為模擬小腸液。37 ℃恒溫水浴搖床震蕩，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)后間隔一段時(shí)間取袋外消化液1 mL，以鄰苯二胺紫外分光光度法測(cè)定其吸光度、折算硒含量，并補(bǔ)充等量的模擬消化液，平行測(cè)得3次取均值，計(jì)算以下指標(biāo)。

(1)

(2)

(3)

借助單因素實(shí)驗(yàn)考察壁材比、芯壁比、復(fù)凝pH值、交聯(lián)劑用量對(duì)復(fù)合載藥微球包埋率的影響。

1.2.3.1 壁材比對(duì)包埋率的影響

1.2.3.2 芯壁比對(duì)包埋率的影響

1.2.3.3 CaCl2用量對(duì)包埋率的影響

依據(jù)“1.2.1”制備流程，在條件實(shí)驗(yàn)確定的壁材比和芯壁比下，改變交聯(lián)劑CaCl2用量(0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0g)，其余制備條件不變，制備復(fù)合載藥微球樣品。隨后采用“1.2.3”體外釋放實(shí)驗(yàn)方法，提取消化實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后1 h的消化液，測(cè)量微球在兩種消化液中的包埋率。

1.2.3.4 復(fù)凝pH值對(duì)包埋率的影響

依據(jù)“1.2.1”制備流程，在條件實(shí)驗(yàn)確定的壁材比、芯壁比和交聯(lián)劑CaCl2用量下，考慮到壁材殼聚糖只能溶解于酸性溶液[9]，所以將復(fù)凝pH設(shè)定在弱酸性環(huán)境，使用HCl、NaHCO3溶液改變復(fù)凝pH值(3.5～4.0、4.0～4.4、4.5～5.0、5.0～5.5、5.5～6.0)，其余制備條件不變，制備復(fù)合載藥微球樣品。隨后采用“1.2.3”體外釋放實(shí)驗(yàn)方法，提取消化實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后1 h的消化液，測(cè)量微球在兩種消化液中的包埋率。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合載藥微球制備條件

在“1.2.3”單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用BBD響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，確定的最佳條件優(yōu)化復(fù)合載藥微球制備工藝，制備優(yōu)化型復(fù)合載藥微球，對(duì)比優(yōu)化前后微球的包埋率和載藥量；借助體外釋放實(shí)驗(yàn)，測(cè)試優(yōu)化型復(fù)合載藥微球在兩種模擬消化液中0.5～12 h的釋放性能。

2 實(shí)驗(yàn)與分析

2.1 微球結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 微球形貌表征與粒徑分析

復(fù)合載藥微球樣品的SEM如圖1所示，圖中微球分散良好、表面凹凸不平，部分微球表面具有不規(guī)則的凹坑和孔洞，使其具有較大的比表面積，且上述凹坑或孔洞還可成為內(nèi)部藥物擴(kuò)散的通道。復(fù)合載藥微球樣品的激光粒度分析檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，載藥微球樣品的中粒徑D50為10.7 μm，大部分微球樣品(D10～D90)分布在6.2～12.9 μm范圍內(nèi)。

A液中殼聚糖(CS)膠束帶正電荷，B液中溶有的海藻酸鈉(SA)膠束帶負(fù)電荷，同時(shí)賴氨酸(Lys)的等電點(diǎn)PI=9.74，溶于B液(pH<7)的L-鹽酸賴氨酸(LMH)電離后以陽(yáng)離子形式存在。試驗(yàn)中，當(dāng)少量B液緩慢滴入大量A液，混合溶液的黏度較低，兩種帶有相反電荷的壁材在CaCl2作用下會(huì)迅速完成交聯(lián)、混凝、聚沉，形成小粒度微球[10]。

圖1 復(fù)合載藥微球樣品的SEM形貌Fig.1 The SEM of drug-loading microspheres

圖2 復(fù)合載藥微球樣品的激光粒度分析Fig.2 Particle size analysis of drug-loading microspheres

2.1.2 紅外光譜分析

如圖3所示，CS的紅外吸收?qǐng)D譜中，3 430 cm-1處的寬峰是-OH與-NH2的收縮振動(dòng)多重耦合峰，1 640cm-1處是酰胺I譜帶的羰基吸收和-NH2振動(dòng)吸收的多重耦合峰。SA的紅外吸收?qǐng)D譜中，3 430 cm-1處的寬峰是-OH的收縮振動(dòng)峰，1 630 cm-1處是-COO-的收縮振動(dòng)峰。LMH的紅外吸收?qǐng)D譜中，2 940 cm-1處是C-H振動(dòng)峰，1 622 cm-1處是-CO-的吸收峰，1 595cm-1和1 340 cm-1處是-COO-的不對(duì)稱和對(duì)稱收縮振動(dòng)峰，1 550 cm-1處吸收峰以及低波數(shù)范圍出現(xiàn)的上下波動(dòng)可能是Cl-的影響，這在LMH標(biāo)準(zhǔn)IR譜中同樣可見(jiàn)。

微球的紅外吸收?qǐng)D譜中，兩種壁材3 430 cm-1處的吸收峰在微球中沒(méi)有改變，說(shuō)明微球中SA和CS中原有的氫鍵結(jié)構(gòu)沒(méi)有改變；CS的1 640 cm-1處-NH2振動(dòng)吸收峰和SA的1 630 cm-1處-COO-的收縮振動(dòng)峰紅移至1 622 cm-1處，與LMH的-CO-吸收峰合并，說(shuō)明兩種壁材復(fù)凝聚形成微球主要依靠CS上氨基與SA的羧基形成氫鍵。而LMH上1 595 cm-1和1 340 cm-1處-COO-的不對(duì)稱和對(duì)稱伸縮(收縮)振動(dòng)峰在微球上沒(méi)有出現(xiàn)，可能是其在微球形成過(guò)程中與壁材CS和SA中的-NH2和-OH形成了氫鍵所致，此時(shí)C-H受到壁材CS和SA中苯環(huán)或糖環(huán)的影響，C-H振動(dòng)加強(qiáng)，由2 940 cm-1紅移至2 926 cm-1。整體而言，微球與其主要組成的紅外光譜在形態(tài)上大致相同。綜合以上，能夠證實(shí)兩種壁材主要是以氫鍵和靜電作用復(fù)凝聚形成復(fù)合載藥微球。

2.1.3 熱重-差熱分析

復(fù)合載藥微球樣品及其組成材料的熱穩(wěn)定性分析如圖4所示。圖中微球的DTA-TGA圖譜有別于微球組分CS、SA、LMH的DTA-TGA插圖，微球與其組分的具有不同的熱分解溫度，說(shuō)明CS、SA、LMH在復(fù)合載藥體系中并非簡(jiǎn)單的混合，存在氫鍵和靜電作用等結(jié)合力使得壁材復(fù)凝聚形成微球。

由微球的TGA曲線可見(jiàn)，微球的受熱減重可分為“失水，脫羧，熱分解”三個(gè)階段。從室溫加熱至800 ℃，該微球樣本的失重率為88.50%。其中：190 ℃以內(nèi)，隨著溫度的升高，復(fù)合載藥微球樣品先后失去其中的物理和化學(xué)結(jié)合水，失重20.35%；190～480 ℃，微球中的CS-SA殼膜、LMH發(fā)生脫羧反應(yīng)，其有機(jī)部分中羧基逐漸分解成CO2，致使微球樣本快速失重45.01%?？紤]到微球的結(jié)構(gòu)，CS-SA殼膜可能先于LMH發(fā)生脫羧；480～525 ℃，微球有機(jī)部分CS、SA、LMH的碳骨架開(kāi)始發(fā)生熱分解，裂解出CO2、CO、H2O等，微球繼續(xù)減重18.33%；525 ℃之后，微球失重不明顯。由微球的DTA曲線可見(jiàn)，77 ℃處的吸熱峰對(duì)應(yīng)吸附水的脫除，位置與TGA曲線中失重第一臺(tái)階吻合；強(qiáng)放熱峰出現(xiàn)的位置對(duì)應(yīng)有機(jī)物熱分解快速失重，其位置與TGA曲線中失重第三臺(tái)階吻合，分解溫度為516 ℃。

圖3 復(fù)合載藥微球樣品及組分的的紅外光譜Fig.3 The infrared spectrums of drug-loading microspheres and its components

圖4 復(fù)合載藥微球樣品及組分的TGA-DTA分析Fig.4 The TGA-DTA of drug-loading microspheres and its components

2.1.4 微球元素組成分析

微球及其組分的主要元素分析如表1所示，其中微球C、H、N、Se四種元素的含量分別為34.92%、6.53%、5.01%和2.47%。由于微球組分CS和SA、LMH中分別自帶Na+和Cl-；同時(shí)，在復(fù)凝聚法制備微球過(guò)程中添加的CaCl2、混合磷酸鹽會(huì)帶入Ca、P等雜質(zhì)；結(jié)合微球形成主要借助氫鍵及靜電作用，故無(wú)法通過(guò)減量法計(jì)算O含量、進(jìn)而推導(dǎo)微球可能的組成式。

表1 復(fù)合載藥微球與其組分的主要元素組成分析Table 1 Major elemental analysis of type II drug-loading microspheres and its components

2.2 體外釋放單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 壁材比對(duì)包埋率的影響

圖5 壁材比、芯壁比對(duì)載藥微球樣品包埋率的影響Fig.5 The influence of ratio of wall to wall and ratio of core to wall to the embedding rate of microspheres注：a：模擬小腸液；b：模擬胃液，下同。Note:a:Simulated small intestinal juice;b:Simulated gastric juice,the same below.

2.2.2 芯壁比對(duì)包埋率的影響

2.2.3 CaCl2用量對(duì)包埋率的影響

如圖6(1)所示，改變交聯(lián)劑CaCl2用量，采用“1.2.3.3”流程制備出的不同復(fù)合載藥微球樣品置于兩種模擬消化液中1 h后，包埋率均出現(xiàn)急增緩減的變化趨勢(shì)，最大包埋率對(duì)應(yīng)的CaCl2用量為0.75 g(7.5 mg/mL)。實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象說(shuō)明交聯(lián)劑CaCl2用量的增大并不能持續(xù)提高復(fù)合載藥微球的藥物包埋率，這是由于交聯(lián)劑用量超過(guò)了飽和交聯(lián)所需濃度時(shí)，多余的鈣離子一部分游離于體系中使溶液的離子強(qiáng)度增大，剩余的部分鈣離子會(huì)吸附在微球表面的高分子壁材殼膜上，導(dǎo)致其極性增強(qiáng)、親水性增大[13]。兩者結(jié)合致使復(fù)合載藥微球樣品的溶脹速度加快，藥物包埋率降低。

圖6 CaCl2用量、復(fù)凝pH對(duì)載藥微球樣品包埋率影響Fig.6 The influence of dosage of CaCl2 and complex coacervation pH to the embedding rate of microspheres

2.2.4 復(fù)凝pH值對(duì)包埋率的影響

如圖6(2)所示，隨著復(fù)凝pH的增大，采用“1.2.3.4”流程制得的不同復(fù)合載藥微球樣品置于兩種模擬消化液中1 h后，測(cè)得的微球包埋率均呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢(shì)。此種現(xiàn)象可能與海藻酸鈉的自身性質(zhì)有關(guān)，海藻酸鹽沉淀pH值為3.6以下，溶解pH值為5.8[14]，使用其作為壁材包裹芯材，當(dāng)溶液酸性減弱時(shí)，有利于微球壁材中海藻酸鈉溶解，導(dǎo)致微球殼膜加速崩解，藥物釋放率激增，包埋率驟減。圖中，采用復(fù)凝pH=4.0～4.5制備的復(fù)合載藥微球樣品在模擬小腸液中具有最大的包埋率；而在模擬胃液中，雖然采用復(fù)凝pH=4.5～5.0制備的復(fù)合載藥微球樣品具有最大的包埋率，但與復(fù)凝pH=4.0～4.5時(shí)制備的微球樣品的包埋率差別不大(△=0.1%)。綜合考慮之下，為了減緩微球殼膜的溶解，提高包埋率，選取復(fù)凝pH=4.0～4.5作為制備條件。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合載藥微球制備工藝與緩釋性能分析

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果上，根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理構(gòu)建響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，因素及水平如表2所示。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示，其中1～24號(hào)是析因?qū)嶒?yàn)，25～29號(hào)為中心試驗(yàn)，中心實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次以衡量實(shí)驗(yàn)誤差。

2.3.2 方差分析

使用Design-Exper8.0.6軟件對(duì)表3中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得回歸方程：

包埋率=80.72+8.32A+5.47B+9.13C+4.10D-2.61AB-6.02AC+3.76AD-8.14BC-5.03BD+0.33CD-7.19A2-8.93B2-7.65C2-11.93D2(4)

由表4所示，該回歸模型極顯著(P<0.000 1)，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.971 4，調(diào)整相關(guān)系數(shù)RAdj=0.942 7，失擬項(xiàng)P=0.070 9>0.05不顯著，說(shuō)明該回歸模型(式4)能夠充分?jǐn)M合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可利用此回歸模型優(yōu)化復(fù)合載藥微球的制備工藝。表3中：一次項(xiàng)A、B、C、D，交互項(xiàng)AC、BC、BD，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2極為顯著；交互項(xiàng)AD顯著；AB、CD不顯著。比較各因素的F值，得出各因素對(duì)載藥微球包埋率影響的主次順序?yàn)椋航宦?lián)劑用量(C)>壁材比(A)>芯壁比(B)>復(fù)凝pH(D)。

表2 因素水平與編碼Table 2 Factor levels and code

表3 BBD響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design and results

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance for the developed regression model

2.3.3 響應(yīng)面圖分析與優(yōu)化

為了更直觀地探討上述因素之間的交互影響，固定任意兩個(gè)因素，考察另兩因素間的交互作用。利用Design-Exper軟件繪制兩因素交互作用的3D響應(yīng)面圖，如圖7所示。

3D響應(yīng)面曲面坡度的陡峭程度反映因素間交互作用的強(qiáng)弱；曲面的最高點(diǎn)與等高線圖的圓心點(diǎn)對(duì)應(yīng)，指向給定的因素水平下因素交互作用的極值。圖7中，AC、BC的交互作用峰面明顯比其他4個(gè)交互作用峰面陡峭，說(shuō)明在整個(gè)6個(gè)交互作用中AC、BC的交互作用是最顯著的，這與表3方差分析中AC、BC交互作用的P值(PAC=0.001 5、PBC=0.000 1)分列倒數(shù)第一和倒數(shù)第二相吻合。

圖7 兩因素交互作用對(duì)包埋率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots of embedding rate showing the interactive effects of two factors

2.3.4 體外模擬緩釋性能驗(yàn)證

依據(jù)“1.2.3”體外釋放實(shí)驗(yàn)方法，考察優(yōu)化后的復(fù)合載藥微球在兩種模擬消化液浸泡(0.5～12 h)后的釋放效果，如圖8所示。

圖8 優(yōu)化后的復(fù)合載藥微球體外模擬緩釋性能Fig.8 The in vitro slow-release performance of optimized composite carrier drug microsphere注：a：模擬胃液；b：模擬小腸液。Note:a:Simulated gastric juice; b:Simulated small intestinal juice.

實(shí)驗(yàn)表明，優(yōu)化后的復(fù)合載藥微球在(0.5～12 h)時(shí)間范圍內(nèi)的藥物累積釋放率呈現(xiàn)“慢―快―慢”的變化趨勢(shì)。微球在模擬消化液中浸泡的初期，致密的高分子壁材殼膜還來(lái)不及全面溶脹崩解、其結(jié)構(gòu)尚完整，只有微球表面粘附和淺表層夾帶的少量NanoSe開(kāi)始釋放，對(duì)應(yīng)第一階段“慢”釋放(圖8中0.5～1 h)；隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，高分子壁材殼膜由表及里開(kāi)始全面溶脹崩解，大量釋放通道出現(xiàn)，內(nèi)部芯材的藥物釋放速度加快，表現(xiàn)為一定程度的突釋，對(duì)應(yīng)第二階段“快”釋放(圖8中1～5 h)；隨著微球殼膜的徹底破壞及芯材表層中藥物濃度的降低，微球內(nèi)部載藥向外擴(kuò)散的難度逐漸增大，藥物擴(kuò)散速度開(kāi)始減慢，進(jìn)入第三階段“慢”釋放(圖8中5～12 h)[15,16]。

相同時(shí)間下，復(fù)合載藥微球在模擬胃液中的累積釋放率大于其在模擬小腸液中，說(shuō)明消化液pH降低有利于藥物釋放。體外模擬消5、7 h，載藥微球在模擬胃液和模擬小腸液中的累積釋放率達(dá)到73.08%和57.95%、78.57%和65.80%。考慮到混合型食物消化排空進(jìn)入大腸需要5～7 h，在此時(shí)間內(nèi)，微球已將大部分藥物平穩(wěn)釋放出去，緩控釋效果達(dá)到預(yù)期設(shè)想。

3 結(jié)論

SEM形貌表征與激光粒徑分析證實(shí)，以殼聚糖(CS)、海藻酸鈉(SA)為壁材，納米硒(NanoSe)為芯材，L-鹽酸賴氨酸(LMH)作為復(fù)合營(yíng)養(yǎng)物，采用一步復(fù)凝法制備的NanoSe-LMH-CS-SA復(fù)合載藥微球具有較小的粒度分布，其表面不規(guī)則凸凹結(jié)構(gòu)有助于增大微粒比表面積大，適合作為緩控釋載體。紅外光譜分析證實(shí)CS和SA通過(guò)靜電作用復(fù)凝聚構(gòu)成微球殼膜，復(fù)合營(yíng)養(yǎng)物L(fēng)MH在成球過(guò)程中與壁材存在一定的靜電作用。

在體外模擬消化0.5～12 h范圍內(nèi)，載藥微球的整個(gè)釋藥過(guò)程突釋短、緩釋長(zhǎng)，體外模擬消化12 h，在模擬胃液和模擬小腸液中累積釋放率分別達(dá)到84.29%和74.45%，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)制備的NanoSe-LMH-CS-SA復(fù)合載藥微球具備良好的緩控釋作用。相比于現(xiàn)有的補(bǔ)硒制劑，微球負(fù)載的NanoSe具有突出的低毒高效性，同時(shí)復(fù)合的LMH可有效調(diào)節(jié)我國(guó)居民膳食性賴氨酸攝入不足，契合當(dāng)前營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑強(qiáng)調(diào)“功能復(fù)合”的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)思路，有望成為一種高效的復(fù)合緩釋型補(bǔ)硒制劑。