EGCG聯(lián)合順鉑抑制骨肉瘤MG-63細胞增殖、侵襲及遷移作用的實驗研究

黃 磊，鄒日昌，宋嘉琪，羅 超，殷嫦嫦

1南昌大學(xué) 研究生院醫(yī)學(xué)部；2南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，南昌 330006；3撫州市立醫(yī)院骨科，撫州 344000；4九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，九江 332000

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是骨最常見的惡性腫瘤，好發(fā)于長骨的干骺端，常見于兒童和青少年，惡性程度高，預(yù)后差，容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除聯(lián)合新輔助化療、輔助化療相結(jié)合為OS的主要治療方式[1]，在臨床治療中，多柔比星、順鉑、異環(huán)磷酰胺等是常用于治療骨肉瘤的化療藥物。隨著醫(yī)療水平的進步，新輔助化療能夠有效提高患者5年生存率，但仍有30%～40%患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，尤其是對于已出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移者，往往導(dǎo)致呼吸衰竭，預(yù)后極差[1-2]。因此，尋找新的治療OS的方法已經(jīng)成為近幾年醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大熱點。

茶文化在我國有幾千年的文化歷史，茶中的主要活性成分為兒茶素，包括沒食子酸兒茶素(gallocatechin，GC)、表沒食子酸兒茶素(epigallocatechin，ECG)、表沒食子酸兒茶素沒食子酸磷脂(epigallocatechin gallate，EGCG)及表兒茶素(EC)等[3]。EGCG是一類既親水又親脂的兩性分子，能夠在體液中充分溶解，輕松穿過細胞膜與細胞內(nèi)靶點相結(jié)合[3]。大量研究表明EGCG含有多種活性基因，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用，這些基團可以與轉(zhuǎn)錄生長因子、蛋白激酶、細胞因子和酶等多種分子靶點結(jié)合而相互作用，導(dǎo)致癌細胞的凋亡。因此EGCG是一類理想的潛在抗癌藥物。已有研究報道EGCG能夠抑制宮頸癌細胞、肝癌細胞及胰腺癌細胞的增殖，在預(yù)防肝膽腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[4-6]。順鉑(cisplatin，CDDP)為骨肉瘤臨床治療中常用的化療藥物，在近年來的臨床治療中，多應(yīng)用以CDDP為核心的聯(lián)合化療方案治療骨肉瘤患者，且聯(lián)合用藥能夠很好的提高療效、降低耐藥性。但是CDDP的副作用較大，最主要的就是腎毒性[7]，往往造成急性腎損傷，并呈劑量、時間相關(guān)性，這也在一定程度上限制了其在臨床上的應(yīng)用。大量抗氧化復(fù)合物如番茄紅素[8]、銀杏果提取物[9]、迷迭香[10]等均能減輕CDDP的腎毒性，EGCG是一類抗氧化酶，具有較強的抗氧化、抗腫瘤、抗炎等作用，在醫(yī)藥及保健食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，已有研究報導(dǎo)EGCG能夠通過提高細胞的抗氧化能力達到減少CDDP對細胞的損傷[11]。本研究將ECGC聯(lián)合CDDP作用于人骨肉瘤MG-63細胞，探討其抑制骨肉瘤生長的作用機制，為臨床尋找高效、低毒的新型抗癌化療方案提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人骨肉瘤MG-63細胞株為本實驗室凍存，EGCG(美國Sigma公司，純度≥98%)，順鉑(美國Sigma公司)，胰蛋白酶-EDTA消化液(北京Solarbio公司)、DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)、胎牛血清(美國Gibco公司)；兔抗人Bax、Bcl-2、Bcl-xL、MMP-2、MMP-9、Caspase-3、cleaved Caspase-3抗體(美國Proteintech 公司)；CCK-8試劑盒(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)；Transwell(美國Millipore公司)；25 cm2塑料培養(yǎng)瓶、6孔板、96孔培養(yǎng)板(美國Corning公司)；AnnexinⅤ-PE/7AAD細胞凋亡檢測試劑盒 (BD公司)；BCA蛋白定量分析試劑盒(北京Solarbio公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；封閉奶粉(蒙牛公司)；倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；酶標(biāo)儀、電泳槽(美國BIO-RAD公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 器材準(zhǔn)備

本實驗所需要使用的器械及其他材料均經(jīng)過高壓蒸汽鍋高溫(126 °C)滅菌30 min以上，再放入烘箱中干燥，備用。

2.2 細胞培養(yǎng)、分組及細胞形態(tài)觀察

將骨肉瘤MG-63細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基的7 mL培養(yǎng)瓶中。置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞均勻貼壁生長，隔天換液，換液時使用PBS清洗，當(dāng)細胞達75%～85%匯合率時，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。分別用倒置顯微鏡觀察各組細胞貼壁生長狀況及形態(tài)變化。EGCG聯(lián)合CDDP實驗分為空白對照組、EGCG組(60 μmol/L)、CDDP組(60 μmol/L)、聯(lián)合用藥組(EGCG 60 μmol/L+CDDP 60 μmol/L)。

2.3 CCK-8法檢測不同藥物對MG-63細胞活力的影響

調(diào)整MG-63細胞至1×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，DMEM培養(yǎng)基至每孔100 μL，設(shè)置濃度梯度，EGCG組：0(對照組)、20、40、60、80、100 μmol/L；CDDP組：0(對照組)、20、40、60、80、100 μmol/L，每組細胞接種5個復(fù)孔，待細胞生長貼壁后加入不同濃度EGCG及CDDP，常規(guī)培養(yǎng)72 h后每孔加入CCK-8試劑100 μL，孵育2 h后酶標(biāo)儀測定其450 nm處吸光度值(A)，取對照組抑制率為0%。后收集各組培養(yǎng)基，加入乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒中的NAD+/INT/diaphorase配置成的混合液，室溫下孵育30 min，最后用酶標(biāo)儀檢測96孔板中490 nm波長處的吸光度，吸光度值表示LDH水平，以培養(yǎng)基中LDH水平反映細胞壞死情況。

2.4 Transwell侵襲試驗

將Transwell小室放入24孔板中，在小室的上室中加入50 μL Martrigel基質(zhì)膠(Martrigel膠與無血清無雙抗培養(yǎng)基1∶8稀釋)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中，風(fēng)干5 h，待Martrigel基質(zhì)膠凝固后棄去上層培養(yǎng)液，收集MG-63細胞，調(diào)整細胞密度至1×105個/mL，接種于Transwell小室的上室中，加入EGCG組、CDDP組、聯(lián)合用藥組(EGCG+CDDP)培養(yǎng)液(分組同“2.1”)，以DMSO為對照，下室加入500 μL含20% FBS培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后取出小室，用棉簽試去小室膜內(nèi)層細胞，置于4%多聚甲醛固定15 min，風(fēng)干后置于結(jié)晶紫中染色20 min，超純水洗滌，干燥后將小室倒置于顯微鏡下，隨機選取5個視野觀察并計數(shù)侵襲至小室下層的細胞，計算平均值。

2.5 細胞劃痕試驗

胰蛋白酶消化MG-63細胞后接種于6孔板中，待細胞生長密度達80%左右時用100 μL槍頭在孔中劃一條直線，PBS漂洗后，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基與EGCG組、CDDP組、聯(lián)合用藥組(EGCG+CDDP)培養(yǎng)液(分組同“2.1”)，每組重復(fù)3次，分別培養(yǎng)24、48 h后拍照。

2.6 流式細胞術(shù)檢測EGCG聯(lián)合CDDP對MG-63細胞凋亡的影響

分別收集對照組、EGCG組、CDPP組和聯(lián)合用藥組MG-63細胞后轉(zhuǎn)入5 mL離心管中，1 000 ×g 4 ℃離心10 min，收集細胞，棄上清。用預(yù)冷PBS液洗細胞2次，棄上清，收集細胞沉淀，將細胞重懸于500 μL結(jié)合緩沖液中。加入5 μL Annexin V-PE混勻后加入5 μL 7-ADD，混勻后于室溫避光孵育15 min。1 h內(nèi)在流式細胞儀(FACS)檢測各組細胞凋亡情況。

2.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達水平

同“2.1”方法分組培養(yǎng)48 h后，PBS漂洗后分別提取各組細胞總蛋白，使用BCA法測定各組蛋白濃度，進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，之后將膠內(nèi)蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后再用相應(yīng)二抗孵育2 h，適當(dāng)漂洗，化學(xué)發(fā)光后放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察條帶，分析結(jié)果。目的蛋白包括Bax、Bcl-2、Bcl-xL、MMP-2、MMP-9、Caspase-3、及cleaved Caspase-3。

2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，并通過Scheffe檢驗進行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 形態(tài)學(xué)觀察

顯微鏡下見空白對照組MG-63細胞貼壁良好，細胞形態(tài)大小不一，分布均勻，多呈梭形，胞核清晰，胞質(zhì)均勻透亮；EGCG組可見部分細胞脫落降解，貼壁細胞數(shù)減少，部分脫落細胞形態(tài)由梭形變圓，變小，細胞間距增大，且隨著藥物濃度梯度增加細胞死亡數(shù)量越多；CDDP組可見較多細胞脫落，貼壁細胞密度減低，也隨藥物濃度梯度的增加細胞死亡數(shù)也增加；聯(lián)合用藥組可見大量細胞壞死脫落，細胞數(shù)量急劇減少，培養(yǎng)液中可見較多懸浮死細胞，隨著時間的延長也愈加明顯(圖1)。

3.2 不同濃度EGCG及CDDP均能抑制MG-63細胞增殖

如圖2所示，CCK-8結(jié)果顯示與對照組相比，不同濃度的EGCG及CDDP均能不同程度抑制骨肉瘤MG-63細胞增殖(P<0.05)，造成細胞活力下降，且隨著藥物濃度的增加，對細胞的抑制作用愈加明顯(P<0.05)。各組分別取100 μL細胞上清于酶標(biāo)板中檢測LDH釋放率，各組LDH釋放量如下：對照組LDH釋放量約為0.86±0.17 μU/mL，EGCG組、CDDP組釋放量分別為1.63±0.21 μU/mL與2.18±0.37 μU/mL，而聯(lián)合用藥組中約為5.61±0.53 μU/mL，表明單藥組中LDH釋放量水平均高于空白對照組，而聯(lián)合用藥組中LDH釋放量最高(P均<0.05)，EGCG組及CDDP組兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在EGCG、CDDP濃度超過60 μmol/L后抑制率曲線進入平臺期，表明這也是藥物效果最佳濃度。

3.3 EGCG聯(lián)合CDDP對 MG-63細胞增殖抑制作用更為顯著

分別使用EGCG、CDDP單藥及EGCG+CDDP聯(lián)合用藥作用于MG-63細胞(分組同“2.1”)，結(jié)果如圖3示，與對照組、ECGC組及CDDP組相比，聯(lián)合用藥組在不同時間(24、48、72 h)對MG-63細胞抑制作用更為顯著，表明加入EGCG聯(lián)合用藥后能夠增強CDDP對骨肉瘤MG-63細胞增殖抑制作用，且隨著作用時間的延長抑制作用也更強(P<0.05)。

圖1 不同時間EGCG組、CDDP組、聯(lián)合用藥組細胞生長情況(×100)Fig.1 Cell growth in EGCG group,CDDP group and combination group at different time (×100)

圖2 EGCG與CDDP對MG-63細胞抑制率(n=3)Fig.2 Inhibition rate of EGCG and CDDP on MG-63 cells (n=3)

圖3 不同時間EGCG組、CDDP組及EGCG 聯(lián)合CDDP組對MG-63細胞抑制率(n=3)Fig.3 Inhibition rate of MG-63 cells in EGCG group, CDDP group and combination group at different time(n=3)注：與對照組相比，*P<0.05；與EGCG組相比，#P<0.05；與CDDP組相比，▲P<0.05；下同。Note:Compared with the control group,*P<0.05;Compared with the EGCG group,#P<0.05;Compared with the CDDP group,▲P<0.05;the following is the same.

3.4 EGCG聯(lián)合CDDP抑制骨肉瘤MG-63細胞的侵襲能力

用不同濃度EGCG、CDDP及聯(lián)合用藥組處理MG-63細胞，采用Transwell小室法檢測對MG-63細胞的侵襲能力，結(jié)果如圖4所示，對照組及DMSO組穿透小室膜的細胞數(shù)分別為296.74±56.61個和275.26±31.12個，EGCG組穿過小室膜的細胞數(shù)為176.23±16.76個，CDDP組穿過小室膜的細胞數(shù)為121.26±10.15個，聯(lián)合組穿個小室膜的細胞數(shù)為42.69±9.96個，與對照組相比，EGCG組及CDDP組穿過小室膜細胞數(shù)均減少，MG-63細胞侵襲能力減弱；聯(lián)合用藥組穿過小室膜細胞數(shù)減少更為顯著，作用更明顯，表明聯(lián)合用藥對MG-63細胞的侵襲能力抑制作用最強，加入EGCG后能夠增強CDDP對骨肉瘤MG-63的抑制作用，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 Transwell小室法檢測EGCG、CDDP及聯(lián)合用藥對MG-63細胞侵襲能力的影響Fig.4 Using Transwell chamber assay to detect the effects of EGCG,CDDP and their combination on the invasive ability of MG-63 cells

3.5 EGCG聯(lián)合CDDP對骨肉瘤MG-63細胞遷移能力影響

細胞劃痕實驗檢測各組藥物對MG-63細胞遷移能力影響，結(jié)果如圖5所示，相比于對照組，EGCG組及CDDP組MG-63細胞遷移能力均下降，EGCG單藥組細胞劃痕劃痕面積愈合率為53.25%±6.21%，CDDP單藥組細胞劃痕面積愈合率為43.27%±5.76%，并伴隨少量細胞的脫落壞死，細胞向中線增殖減慢；而EGCG+CDDP聯(lián)合用藥組細胞遷移能力明顯減弱，細胞劃痕愈合率為22.69%±3.88%，幾乎未見細胞向中線增長，表明EGCG聯(lián)合CDDP能更有效的抑制骨肉瘤MG-63細胞增殖,聯(lián)合用藥能夠增強骨肉瘤MG-63細胞對CDDP的敏感性(P<0.05)。

圖5 EGCG、CDDP及聯(lián)合用藥對骨肉瘤MG-63細胞遷徙的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of EGCG,CDDP and their combination on the migration of osteosarcoma MG-63 cells

3.6 EGCG聯(lián)合CDDP對骨肉瘤MG-63細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)如圖6所示，與對照組相比，EGCG組、CDDP組凋亡率增加，分別為 10.336%±0.028%、19.681%±3.755%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而EGCG+CDDP聯(lián)合用藥組凋亡率更高，凋亡率為48.279%±7.608%，與EGCG組及CDDP組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示兩藥聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著誘導(dǎo)骨肉瘤MG-63細胞凋亡。

圖6 EGCG聯(lián)合CDDP對骨肉瘤MG-63細胞凋亡的影響Fig.6 Effects of EGCG combined with CDDP on apoptosis of osteosarcoma MG-63 cells

3.7 Western blot檢測MG-63細胞相關(guān)蛋白表達情況

Western blot結(jié)果及灰度分析結(jié)果如圖7所示：顯影后的條帶越黑越粗說明蛋白表達量越高，與對照組相比，分別單藥應(yīng)用EGCG、CDDP及將二者聯(lián)合用藥后，細胞中MMP-2、MMP-9、Bcl-2與Bcl-xL表達水平下調(diào)，同時Bax、Caspase-3以及cleaved Caspase-3蛋白水平上調(diào)，其中以聯(lián)合用藥組作用效果更明顯，表明EGCG+CDDP對骨肉瘤MG-63細胞抑制作用效果最強，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖7 EGCG組、CDDP組及聯(lián)合用藥組對MG-63細胞相關(guān)蛋白表達的影響Fig.7 Effects of EGCG group,CDDP group and combination group on the expression of related proteins in MG-63 cells

4 討論與結(jié)論

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，好發(fā)于兒童與青少年[12]，盡管有手術(shù)、新輔助化療及手術(shù)聯(lián)合輔助化療的治療方法，骨肉瘤患者的致死率仍較高，尤其對于肺轉(zhuǎn)移者治療效果極差，順鉑為臨床中治療骨肉瘤較為常用的化療藥物，但是近年來越來越多的患者對順鉑產(chǎn)生耐藥性，尋找新的對抗骨肉瘤藥物及聯(lián)合順鉑增強其化療敏感性的方案有極為重要的意義，因此以順鉑為核心的聯(lián)合用藥也成為了骨肉瘤治療領(lǐng)域中的一大研究熱點。

順鉑(CDDP)屬鉑類化療藥物中的一種，具有較強的廣譜抗癌作用，其主要機制是通過抑制惡性腫瘤細胞中的DNA復(fù)制而發(fā)揮細胞毒性及抗腫瘤的作用[8]，臨床上CDDP可用于治療多種惡性腫瘤如甲狀腺癌、肺癌、食道癌、骨肉瘤等，具有較好的化療效果，但是也存在不可避免的弊端如CDDP產(chǎn)生的腎毒性、耳毒性及耐藥性，這也限制了CDDP的臨床應(yīng)用，而腎毒性也是其最主要的副作用[7,13]，因此為順鉑尋找合適的輔藥聯(lián)合作用以減少CDDP藥物毒性及提高整體化療敏感性成為一大熱點，目前臨床中也多應(yīng)用以CDDP為核心的聯(lián)合化療方案，盡可能的在增強CDDP抗腫瘤作用的基礎(chǔ)性減少藥物對組織的損傷。兒茶素是茶中主要的活性物質(zhì)，其中表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯(EGCG)在綠茶中活性最高，具有多種生物特性如抗氧化、抗腫瘤及抗炎性反應(yīng)[14]。已有研究報道EGCG能夠延緩CDDP造成的腎臟腎小球濾過率下降，緩解所致HEK293細胞的氧化損傷，在CDDP誘導(dǎo)的細胞損傷模型中，隨著EGCG濃度的增加，HEK293細胞的存活率也逐漸增加，表明EGCG能夠在一定程度上對抗CDDP的藥物毒性[11]。CDDP對腎臟的損傷與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，而EGCG具有較強的抗氧化性，能夠?qū)寡趸瘧?yīng)激反應(yīng)。有研究證實EGCG能夠改善抗腎小球基底膜性腎小球腎炎，延緩CDDP造成的腎臟腎小球濾過率下降，對腎臟具有保護作用[15,6]。在腫瘤領(lǐng)域中，EGCG表現(xiàn)出廣泛的抗癌作用，已有研究發(fā)現(xiàn)EGCG能夠通過激活JNK信號通路誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡[17]，通過下調(diào)p65的轉(zhuǎn)錄水平抑制膀胱癌的轉(zhuǎn)移[18]、上調(diào)miRNA-1抑制骨肉瘤細胞生長[19]，抑制宮頸癌[4]、肝癌[5]、胰腺癌[6]細胞增殖的作用，這些都為EGCG發(fā)揮保護腎功能與抗癌作用提供了充足的理論依據(jù)。在本研究中，CCK-8實驗結(jié)果及顯微鏡下觀察也表明EGCG具有抑制骨肉瘤MG-63細胞增殖的作用，且EGCG聯(lián)合CDDP能夠發(fā)揮更強的抑制效果，表明二者聯(lián)合作用能夠更有效抑制OS的進展。

通過進一步實驗我們發(fā)現(xiàn)，EGCG聯(lián)合CDDP對骨肉瘤細胞的抑制作用明顯優(yōu)于單藥，在顯微鏡下觀察各組藥物處理的細胞可見，聯(lián)合用藥組的骨肉瘤MG-63細胞大量壞死，漂浮細胞明顯增多，對細胞增殖的抑制作用明顯強于單藥組，表明EGCG聯(lián)合CDDP對MG-63細胞具顯著抑制作用。CCK-8實驗也證實，單獨應(yīng)用EGCG能夠抑制骨肉瘤MG-63細胞生長，且隨著藥物濃度增加及作用時間的延長，細胞增殖抑制更明顯，說明EGCG及CDDP對骨肉瘤MG-63細胞均有抑制作用，且具有劑量、時間依賴性，而在將EGCG與CDDP聯(lián)合應(yīng)用后結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對MG-63細胞的抑制作用顯著強于單藥組；Transwell侵襲實驗結(jié)果表明，與對照組及DMSO處理組對比，EGCG、CDDP單藥應(yīng)用組細胞侵襲能力均降低，穿過小室膜的細胞數(shù)也減少，而聯(lián)合用藥組的MG-63細胞侵襲能力最低，穿過小室膜的細胞數(shù)也最少；細胞劃痕實驗結(jié)果表明，EGCG及CDDP單藥組細胞的遷移能力減弱，劃痕區(qū)域細胞數(shù)目增長減慢，而將EGCG與CDDP聯(lián)合用藥組細胞遷移能力大幅減弱，劃痕區(qū)幾乎沒有明顯細胞增長，同時細胞壞死數(shù)目也增多；Bcl家族是重要的凋亡相關(guān)基因，其中Bcl-2、Bcl-xL是其阻止細胞凋亡的相關(guān)基因，而Bax是促進細胞凋亡的相關(guān)基因，Bcl家族在胃腸道腫瘤、泌尿系腫瘤、骨肉瘤等惡性腫瘤中發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)聯(lián)[20]。通過western blot分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGCG、CDDP單藥組作用后，抗凋亡蛋白Bcl-xL與Bcl-2水平均下調(diào)，而促凋亡蛋白Bax水平明顯上調(diào)，這一結(jié)果在EGCG+CDDP聯(lián)合用藥組更為顯著，提示EGCG能夠促進骨肉瘤MG-63細胞凋亡，與CDDP聯(lián)合作用后效果更為明顯。Caspase家族是一組半胱氨酸蛋白酶，在介導(dǎo)細胞凋亡過程中起到重要作用，其中以Caspase-3最為關(guān)鍵，其激活是細胞凋亡的特異性標(biāo)志[21]。細胞凋亡有多種途徑，但絕大多數(shù)途徑末端都是通過Caspase的級聯(lián)激活，最終激活為Caspase-3，形成具有活性的cleaved Caspase-3片段，進而產(chǎn)生一系列級聯(lián)反應(yīng)[22]。本研究結(jié)果表明在分別單藥應(yīng)用骨肉瘤MG-63細胞后，Caspase-3及cleaved Caspase-3表達水平均增高，而聯(lián)合用藥組升高最為明顯，提示EGCG也許能夠通過上調(diào)Caspase家族基因表達促進MG-63細胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮抗骨肉瘤細胞的作用，流式細胞儀檢測結(jié)果也提示EGCG能夠誘導(dǎo)骨肉瘤MG-63細胞發(fā)生凋亡，且EGCG+CDDP聯(lián)合用藥效果更為顯著。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類蛋白水解酶，可通過破壞基質(zhì)降解平衡而促進癌細胞突破基底膜和細胞外基質(zhì)構(gòu)成的組織學(xué)屏障，侵犯周圍及遠處組織，其中最具有代表性的便是MMP-2及MMP-9兩個家族基因，基質(zhì)金屬蛋白酶的表達水平越高，腫瘤的侵襲能力也越強[23]。本實驗結(jié)果表明，藥物作用骨肉瘤細胞后MMP-2及MMP-9表達水平均下調(diào)，且EGCG+CDDP聯(lián)合組下降最為明顯，表明EGCG聯(lián)合CDDP作用能夠發(fā)揮更為有效的抗骨肉瘤增殖的作用。以上結(jié)果均證實EGCG聯(lián)合CDDP能夠發(fā)揮更為顯著的抑制骨肉瘤的增殖作用。

綜上，本研究表明EGCG能夠在體外抑制骨肉瘤MG-63細胞的增殖，聯(lián)合CDDP用藥后較EGCG及CDDP單藥應(yīng)用效果更強，由于EGCG對細胞具有一定的抗氧化性，能夠保護腎功能，減少CDDP的腎毒性，聯(lián)合用藥還能夠在發(fā)揮療效的基礎(chǔ)上減少CDDP對組織造成的損傷，是一類理想的化療藥物輔藥，這也為骨肉瘤的臨床治療提供了新的理論依據(jù)與有價值的實驗基礎(chǔ)。然而本實驗僅探討了在體外對骨肉瘤MG-63細胞的影響，這也需繼續(xù)完善相關(guān)實驗以及進一步在體內(nèi)實驗中深入探究。