地黃RgCDPK基因的克隆與表達分析

原增艷 宋小鋒 朱畇昊

摘?要：鈣依賴型蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases， CDPKs）是高等植物細胞中重要的鈣離子信號受體，在植物抵御逆境脅迫過程中發揮著重要作用。該研究以地黃為材料，設計特異引物，克隆地黃RgCDPK基因全長序列，并使用在線軟件進行生物信息學分析，采用熒光定量PCR技術進行組織特異性分析。結果表明：（1）克隆得到的地黃CDPK基因長度為1 770 bp，編碼589個氨基酸;（2）多序列比對和結構分析顯示，該蛋白含有鈣依賴蛋白激酶典型結構域絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶區及EF-手性區。系統進化分析表明其與擬南芥 AtCDPK28 的同源關系最近，因此命名為RgCDPK（Genbank登錄號為MT024235）;（3）組織特異性分析得出RgCDPK在地黃葉中表達量最高。該研究成功克隆出地黃CDPK基因，且發現該基因在不同組織中的表達存在差異，為以后深入研究CDPK在地黃連作障礙等生物及非生物脅迫中的分子機制提供理論基礎。

關鍵詞：地黃， 鈣依賴蛋白激酶， 生物信息學， 組織特異性

中圖分類號：Q943.2

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）12-1816-08

Abstract：Calcium-dependent protein kinases （CDPKs） are important calcium sensors in higher plants， which play an important role in plant resistance to envirenment stress.In this study， a full-length cDNA of RgCDPK gene was cloned from Rehmannia glutinosa.Meanwhile， the bioinformatics analysis was used the online software， quantitative real-time PCR technique was used to detect RgCDPK expression level in different tissues.The results were as follows：（1）The full-length cDNA sequence of RgCDPK gene was 1 770 bp and encoded 589 amino acid residues; （2） Multiple sequence alignments and structural analysis revealed that its protein contained serine/threonine protein kinase region and EF-hand region， which were typical domains of calcium-dependent protein kinase.Phylogenetic analysis showed the highest similarity with Arabidopsis AtCDPK28.Thus， the gene was defined as RgCDPK （Genbank accession No.MT024235）; （3）The expression analysis of RgCDPK in different tissues revealed that high transcript levels occurred at leaves.In this study， the CDPK gene of R.glutinosa was successfully cloned， and the expression of the gene in different tissues was found to be different.The results of this study provide theoretical basis for further study on the function of CDPK in biotic， abiotic stresses and continuous cropping obstacles.

Key words：Rehmannia glutinosa， calcium-dependent protein kinase， bioinformatics， tissue specificity

Ca2+ 是植物細胞中重要的第二信使，當一些刺激信號使胞內Ca2+濃度增加至閾值時，產生信號并傳遞。鈣依賴型蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases， CDPKs）是一種普遍存在的蛋白激酶，當CDPK與Ca2+結合后，CDPK被活化發揮作用（Guo et al.， 2019）。CDPK在植物響應高溫、干旱、紫外線等非生物脅迫和內生菌、蟲害等生物脅迫中起重要作用，同時，CDPK也在植物的生長與發育、胞內激素調節等方面都發揮重要作用（Romeis et al.，2000; Geiger et al.，2010）。CDPK基因具有4 個典型的結構域，依次分別為N 末端的可變區、催化區、自抑制區和調控區。調控區一般含有多個Ca2+ 結合的EF 手型結構（EF-hand）。Ca2+與EF-hand結合后， CDPK空間結構發生變化，導致自抑制區的抑制作用解除，促使CDPK 恢復其蛋白激酶活性，進而磷酸化下游調控因子，將信號傳遞至下游調控網絡，從而完成對信號的響應（Hetherington et al.，1982; Harmon et al.，1987）。CDPK在植物根、莖、葉、花、果實和種子等組織中廣泛分布。通過基因組數據分析發現，擬南芥、水稻、玉米基因組中分別有34、31和40個CDPK基因（武志剛等，2018）。多種藥用植物如鐵皮石斛（盛況等，2017）、天山雪蓮（田曉涵等，2016）和龍血樹（張浩等，2010）中的CDPK基因也已被克隆，但地黃CDPK基因克隆的研究還未見報道。

地黃為玄參科植物地黃屬植物地黃（Rehmannia glutinosa）的新鮮或干燥塊根，具有清熱生津、涼血止血、滋陰補血等功效（李慧芬，2014）。地黃栽培歷史悠久，歷代名醫對優質地黃產地的認識幾經變遷，自明朝以來，即確立了懷慶地黃的道地地位。懷地黃具有悠久的藥用歷史，用藥需求不斷增加，但是在栽培生產上，地黃具有嚴重的連作障礙，每茬收獲后需要8～10 a后才能復種（劉紅彥等，2006）。張重義等（2013）研究發現，地黃可能依賴鈣離子信號系統傳遞自毒物質信號，導致連作危害，其中CDPK家族基因在其中也發揮了重要作用。楊楚韻等（2017）在地黃中鑒定出了21個可能參與連作地黃鈣信號感知、傳導和響應連作脅迫進程的CDPK家族基因，但并未對其進行克隆及表達分析。本課題組前期進行了地黃組培苗的轉錄組測序及分析，從中查找到1 條新的編碼鈣依賴性蛋白激酶的基因，并通過比對發現該基因序列完整。本研究分析了該基因編碼蛋白的理化特性、結構特征和亞細胞定位，檢測了其在不同組織中的表達特性，以期為深入研究其在地黃連作障礙等生物及非生物脅迫中的分子機制提供基礎。

1?材料與方法

1.1 材料

材料取自河南中醫藥大學植物園，經朱畇昊副教授鑒定為玄參科地黃（Rehmannia glutinosa）。所用地黃品種為“沁懷”，在6月份地黃開花時，挖取地黃植株整株，洗凈后分別取根、葉、花組織，用錫紙包好，液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱保存，以備后續使用。

1.2 RNA的提取及cDNA 的合成

取新鮮地黃葉片、根、花瓣各0.1 g，在液氮中速凍，用TRIzol 試劑（Thermo Fisher Scientific）提取RNA。RNA使用1%瓊脂糖電泳凝膠檢測純度，檢測合格后用于后續cDNA的合成。取7 μL RNA 使用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]合成cDNA，具體操作方法參照試劑盒說明書進行。

1.3 地黃CDPK基因的克隆

以地黃組培苗轉錄組數據庫中一條注釋為CDPK的unigene全長序列為參考序列，使用Primer Premier 5設計特異性引物，具體見表1。PCR 反應體系為20 μL，具體組分如下：模板cDNA 2.0 μL、2×Es Taq mix 10 μL、上下游引物（RgCDPK-F，RgCDPK-R）各1.0 μL、其余用ddH2O 補足。反應程序設計如下：95 ℃，3 min;95 ℃，45s，58 ℃，45 s，72 ℃，2 min，35個循環;72 ℃延伸 10 min。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，純化回收得到目的片段，使用pMD19-T 載體進行目的片段的連接后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化后產物于含氨芐青霉素的LB固體培養基上37 ℃培養過夜后篩選白斑，菌液經PCR 驗證后送至生工生物工程股份有限公司測序。

1.4 地黃CDPK基因的生物信息學分析

使用ORF Finder（http：//www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html） 進行開放閱讀框查找;使用BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列的同源性搜索;使用Protparam （http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html） 預測蛋白的分子量等理化性質;使用在線軟件SinalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測分析蛋白信號肽;使用TMpred（https：//embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html）預測蛋白跨膜區;使用NPSA server（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopm.html）預測蛋白二級結構;使用PSORT（https：//www.psort.org/）預測蛋白亞細胞定位;使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）預測蛋白功能域;使用NetPhos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在線軟件預測蛋白磷酸化位點;使用MEGA6.0構建系統和進化樹;使用DNAMAN進行多序列比對。

1.5 熒光定量PCR

根據熒光定量引物設計方法，用Primer 5.0設計引物qRgCDPK-F、qRgCDPK-R，以TiP41為內參基因。參照熒光定量PCR試劑盒的步驟，配成20 μL的體系：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、引物各0.4 μL、QN Rox Reference Dye 0.1 μL、ddH2O 7.1 μL、模板cDNA 2 μL。 PCR反應程序如下：預變性95 ℃ 20 s，變性95 ℃ 1 s，退火56 ℃ 20 s，延伸95 ℃ 1 s，40個循環;60 ℃ 20 s，95 ℃ 1 s進行擴增。反應結束后，根據得到的Ct 值，利用2-ΔΔCt，分別計算不同組織的表達量。

2?結果與分析

2.1 RgCDPK基因的克隆

提取后的RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見三條清晰條帶，條帶無降解及雜帶，說明RNA質量較高，無降解，可用于后續實驗。如圖1所示，特異性條帶長度約為1 800 bp。將PCR產物克隆到pMD19-T載體后挑選陽性克隆雙向測序。測序結果拼接后經ORF Finder 預測，該序列含有一個大小為1 770 bp的完整的開放閱讀框，編碼589個氨基酸。測序結果使用DNAMAN軟件與轉錄組序列進行多序列比對發現，克隆所得序列與轉錄組所得序列完全一致。通過BLAST 程序檢索，該片段與紫花風鈴木（Handroanthus impetiginosus，PIN08903.1）、猴面花（Erythranthe guttata，XP_012857661）、旋蒴苣苔（Dorcoceras hygrometricum，KZV40794.1）CDPK 蛋白序列的同源性分別為89%、86%、82%。

采用 InterProScan 在線預測工具對地黃RgCDPK蛋白的保守結構域進行分析，RgCDPK具有5個保守結構域，分別是在126～386位的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域和4個EF-hand，鈣離子結合結構域（433～461，470～498，512～540，542～570）由此確定該序列為地黃CDPK基因的cDNA 全長序列，將其命名為RgCDPK，將其序列提交至GenBank，獲得登錄號為MT024235。

2.2 RgCDPK的生物信息學分析

2.2.1 RgCDPK蛋白質理化性質及疏水性分析?RgCDPK基因的開放閱讀框大小為1 770 bp，共編碼589個氨基酸殘基。RgCDPK蛋白質的相對分子質量為66.06 kD;理論等電點（PI）為5.91，原子組成C2908H4624N832O890S18，總原子數為9 272，帶負電的氨基酸有80個（Asp + Glu），帶正電的氨基酸有89個（Arg + Lys）。蛋白質穩定性分析發現CsCDPK17 的脂肪指數為73.06，不穩定系數為45，推測其為不穩定蛋白質。總平均親水系數為-0.584，屬于親水性蛋白。

2.2.2 RgCDPK蛋白質特性分析?使用TMpred軟件，預測RgCDPK蛋白的跨膜區，結果顯示，RgCDPK蛋白可能存在一個跨膜螺旋，位置為309～327，方向由外到內。使用SignalP 4.1分析RgCDPK的信號肽，結果顯示無明顯信號肽。RgCDPK可能定位于葉綠體。通過在線軟件對地黃RgCDPK蛋白進行磷酸化位點預測，結果顯示，RgCDPK蛋白整個多肽鏈有71個磷酸化位點（>0.5），其中絲氨酸42個，蘇氨酸23個，酪氨酸6個。

2.2.3 RgCDPK的結構預測?使用NPSA server在線軟件預測RgCDPK的二級結構，結果表明RgCDPK蛋白由41.94%的α-螺旋、12.05%的延伸鏈、6.62%的β-轉角和39.39%的無規卷曲組成。使用Swiss-model在線軟件預測地黃RgCDPK的三級結構。同源建模結果顯示（圖2）， RgCDPK與擬南芥CDPK（SMTL ID：3q5i.1）相似度為33.94%，具有較高可信度（>30%）。

通過在線軟件對地黃RgCDPK蛋白進行磷酸化位點預測，結果顯示，RgCDPK蛋白整個多肽鏈有71個磷酸化位點（>0.5），其中，絲氨酸42個，蘇氨酸23個，酪氨酸6個。

2.2.4 RgCDPK的系統進化及同源性分析?使用MEGA6.0構建系統進化樹。擬南芥CDPK蛋白包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個亞族，其中AtCDPK1、AtCDPK2、AtCDPK26屬于Ⅰ家族;AtCDPK15、AtCDPK19、AtCDPK23、AtCDPK29、AtCDPK33、AtCDPK34屬于Ⅱ家族;AtCDPK13、AtCDPK14、AtCDPK24屬于Ⅲ家族;AtCDPK16、AtCDPK18、AtCDPK28屬于Ⅳ家族。如圖3所示，RgCDPK與AtCDPK28處于同一分支，說明其可能屬于CDPK Ⅳ家族，與擬南芥AtCDPK28同源性最近。

運用DNAMAN在線軟件，將芝麻SiCDPK8、紫花風鈴木HiCDPK等與地黃RgCDPK進行多序列比對。如圖4所示，RgCDPK具有4 個典型的CDPK結構域：可變區、催化區、自抑制區和調控區。可變區位于N端，同源性極低;蛋白激酶區保守性較高，由約300 個氨基酸構成，因該區含有起催化作用的Ser/Thr 蛋白激酶序列，因此也可稱為催化區，主要起與ATP 結合的作用;在C端有4個EF-hand結構，此為保守區，主要起促進Ca2+結合的作用，末端保守性較差。

2.3 ?RgCDPK的組織表達分析

使用熒光定量PCR技術分析地黃塊根、葉、花瓣中的表達特性，結果見圖5。由圖5可知，RgCDPK在地黃塊根、葉和花瓣中均有表達，在葉中的表達量最高，而在花瓣中的表達量最低。在根和葉中的表達量差異較小。

3?討論與結論

本研究克隆得到一條新的完整的RgCDPK基因，其開放閱讀框大小為1 770 bp，共編碼589個氨基酸殘基。對RgCDPK基因的結構及編碼的蛋白進行分析發現，其保守結構具有4 個典型的可變區、催化區、自抑制區和調控區，符合鈣依賴蛋白激酶典型結構特征。CDPK在植株中分布廣泛，在根、葉、花、果實及種子等各器官中均能檢測到CDPK基因的表達（Raices et al.，2003;白曉璟等，2019;雷蕾等，2019;Li et al.，2019）。本研究通過熒光定量PCR對RgCDPK在地黃不同組織中的特異性表達結果進行分析，發現RgCDPK在葉中表達量最高，其次是根，在花瓣中的相對表達量最少。鐵皮石斛DoCDPK1也屬于CDPK Ⅳ家族，但其在葉片中表達量最高，其次是莖，在根中表達量最低（盛況等，2017）。說明RgCDPK的表達具有組織特異性，且不同植物中的CDPK即使屬于同一亞家族，其表達模式也可能不同。

本研究克隆得到了1條新的CDPK基因，系統進化分析發現，其可能屬于CDPKD家族，與擬南芥AtCDPK28同源性最近。AtCDPK28缺失引起擬南芥Nacl抗性降低，而其超表達則增加擬南芥對

滲透脅迫的耐受性。同屬于CDPKD家族的DoCDPK1在低溫、ABA與鹽脅迫均可被誘導，因此推測其可能在地黃滲透脅迫等逆境環境中發揮調節作用。連作障礙是指連續在同一土壤上栽培同種作物或近緣作物引起的植物生長發育異常（王剛等，2019），連作過程中植物也受到一定程度的脅迫。已經有研究發現鈣信號系統在地黃連作障礙形成過程中扮演著重要的角色（郭冠瑛等，2013），而鈣依賴蛋白激酶 （CDPK）（張毓露等，2012）在地黃連作的生理響應中可能也發揮著重要作用。CDPK11基因在連作地黃膨大前、中、后期的表達量均顯著高于頭茬地黃，而CDPK20在膨大中期連作地黃中表達量顯著高于頭茬地黃，其他時期均下調（楊楚韻等，2017）。這可能是不同CDPK蛋白通過相互補充和相互增益在地黃連作障礙的形成過程中承擔不同的角色，從而介導地黃連作障礙的形成。RgCDPK基因作為地黃CDPK基因家族中的一員，可能在地黃連作反應中發揮一定的功能，但本研究未對其在地黃連作不同時期、不同組織中的表達特性進行研究，因此其如何參與地黃連作障礙中Ca2+信號轉導及具體的轉導途徑等并不清楚，還需要進行深入的研究。

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（責任編輯?何永艷）