高通量dPCR基因芯片熒光激發測控系統的研制

李龍成，孫劉杰，陸春生

（上海理工大學 出版印刷與藝術設計學院，上海 200093）

引 言

數字聚合酶鏈式反應（digital polymerase chain reaction, dPCR）[1]是20世紀90年代末提出的一種新型核酸絕對定量檢測技術，dPCR技術是指將含有目標基因、引物、聚合酶等的溶液稀釋后，分成幾十到幾十萬份微小、獨立的反應微液滴，每個微液滴中核酸模板數少于或者等于1個。每個反應微液滴完成聚合酶鏈式反應（PCR）擴增后對結果進行熒光檢測，將含有目標基因的反應器標記為“1”（陽性），不含目標基因的反應器標記為“0”（陰性），根據相對比例，并利用泊松分布就能推算出原始溶液的核酸濃度[2]。dPCR技術檢測步驟簡單、可實現絕對定量，且檢測過程中所需樣本少、準確率高，具有高靈敏的單分子檢測能力，是現有PCR技術中最適于疾病早期診斷的方法[3]。dPCR芯片廣泛應用于腫瘤的早期診斷及個體化用藥、胎兒遺傳疾病的早期篩查、轉基因食品監測和基因文庫質量鑒定[4-8]等方面。dPCR基因芯片測控技術正在往大功率、大視場、低成本方向發展。

熒光激發是基因檢測中示蹤物標記常用手段，通過檢測分析示蹤物信號的分布及強弱得到靶分子的生物分子信息。目前市場上常見熒光激發設備中激發光源主要分為激光和LED兩大類型，雖然以激光作為激發光源的激光共聚焦掃描熒光顯微鏡具有分辨率高和信噪比高等性能，但是在實際應用中激光會造成待檢測樣品損傷，對實驗結果產生無法避免的干擾。同時以激光作為激發光源的系統掃描方式多為二維點掃描，大大限制了檢測時間的縮短。以窄帶LED為激發光源的熒光激發系統短時間內能夠在視場中一次成像。同時以窄帶LED為激發光源的設備與激光設備相比具有結構簡單、成本低等顯著優點，LED自身的冷光源屬性不會對聚合酶鏈式反應熱環境及檢測結果產生影響。因此，在閱讀大量國內外文獻基礎上，經過對比分析后，最終選擇以大功率、窄帶LED作為熒光激發光源展開系統的研發設計工作。

目前，國內外研究人員對以LED作為熒光激發光源的設備開展了許多研究。早在2011年10月，Biorad公司研發出公司第一代性能優異的QX100 PCR系統；2012年美國RainDance Technologies公司推出了RainDropTM數字PCR系統；2013年8月，Bio-rad公司研發出性能優異的QX100和QX200數字PCR系統；2016年日本的Yong等用無濾光熒光傳感器檢測亞微米濃度熒光染料溶液中的熒光。該無濾光熒光傳感器具有光柵結構，可根據不同柵電壓下的光電流計算激發強度和熒光燈強度。研制的無濾光熒光傳感器對LED光源的激發光（470 nm）和熒光（530 nm）的分離能力為 1 200∶1[9]。

針對dPCR儀光電系統中以LED作為熒光激發光源的應用，國內高校范圍內的研究人員也做出了多方面的探索。2012年北京工業大學李倩對生物芯片熒光檢測中微體積高強度多LED集成技術與工藝進行了研究[10]。浙江大學對于LED在熒光激發領域的應用開展了深入研究：2011年王偉平等已經開始對96孔實時熒光定量PCR檢測系統的開發進行研究，對LineGene9600實時熒光PCR檢測系統的性能進行優化、提升[11]；2011年徐靈艷開發了一套小型微流控芯片-環介導等溫擴增反應實時濁度檢測系統，通過該系統中對鎢燈和白熾燈為代表的復色光源與激光、激光二極管（LD）、發光二極管（LED）進行對比研究分析[12]；2015年，毛賀在《定量聚合酶鏈式反應熒光檢測技術研究》中對光源激發主波長為470 nm的藍光LED的熒光激發效果進行探索[13]；2016年，袁茂凱等以LED作為熒光激發光源設計了一套穩定性高的專用LED驅動電路及其配套檢測系統[3]。

為了解決dPCR基因芯片熒光激發及檢測過程中激光激發光源成本高、熒光顯微鏡檢測視場小、現有LED作為激發光源功率低等問題，本研究以上海市科學技術委員會地方院校能力建設項目為依托，設計了一套基于STM32微處理器進行控制的系統。系統以大功率、窄帶LED作為激發光源，通過FAM、HEX和ROX三個熒光激發通道，可以一次性單通道完成較大視場內的基因芯片激發。該熒光激發系統具有多個獨立激發通道、單通道LED激發功率大、激發功率可調節、系統熱穩定性好、檢測結果精準等顯著優點。實驗檢測結果說明該系統能夠多通道、快速實現dPCR基因芯片的熒光激發。

1 系統設計

1.1 測控系統架構設計

整個熒光激發系統的設計主要包含熒光激發光源系統、控制電路系統和通信系統三大模塊，整個測控系統各個功能模塊之間架構如圖1所示。

圖1 整個系統的架構設計Fig. 1 The architecture design of the whole system

1.2 熒光激發原理及光源系統設計

熒光激發過程中，當待檢測分子的電子在吸收了特定波長的能量后，待檢測分子的電子將從基態躍遷到激發態。處于激發態的分子為了從激發態回到基態，該分子會馬上釋放出能量，處于激發態的分子回到基態可以通過如圖2所示幾種途徑。

圖2 分子內激發與衰變過程Fig. 2 Intramolecular excitation and decay process

由于檢測分子在S2的狀態是極不穩定的，檢測分子的電子會在10-9～10-7s的時間內重新回到基態，電子由第一激發躍遷到任意一個振動能級而發射的光量子稱為熒光[14]，通過配套的光電系統能夠精準地檢測到待檢測分子中熒光標記物的分布和熒光強度。

如果固定測量熒光的某個發射波長，而不斷改變激發光的波長，得到的熒光強度對激發波長的譜圖即為熒光激發譜，熒光激發譜表明了熒光強度對激發波長的依賴關系[15]。熒光激發過程中結合誘導熒光技術，在激發光（通常為紫外線或低波長可見光）的照射下，吸收能量后的熒光分子變為激發態，處于激發態熒光分子為了回到基態將以輻射光量子的形式釋放出能量并產生熒光信號[16]。

激發光源作為熒光激發系統的關鍵部分，目前市場上常見的dPCR系統設備中，主流的熒光激發光源分為激光和LED兩大類型。作為可選光源的高壓汞燈、高壓氙燈、金屬鹵化物燈等傳統的紫外激發源，以及高相干激光激發源，都具有體積大、成本高、壽命短的缺點[17]。因此，以激光作為激發光源的熒光激發系統一直未得到廣泛應用，在國內完全依賴于國外進口。本系統以大功率、窄帶LED作為激發光源，冷光源LED不會對PCR反應熱環境產生干擾，而且窄帶LED無需過濾便可直接發出單色光[13]。

整個系統設計時選取FAM、HEX和ROX三種常見熒光素作為dPCR反應過程中的熒光染料，根據FAM、HEX和ROX的激發光譜波長分布，分別選擇主峰波長為465～480 nm的藍光LED、主峰波長為520～535 nm的綠光LED、主峰波長為580～600 nm的黃光LED分別作為FAM、HEX和ROX通道的熒光激發光源。

根據圖3中FAM、HEX和ROX激發通道對應熒光素的激發波譜及其所屬LED光源的波譜分布，光源工作系統設計如圖4所示。系統通過對FAM、HEX和ROX通道激發光源工作時間、激發光源功率等的調節可實現基因芯片反應產物的熒光激發。激發光源系統中FAM、HEX和ROX相鄰兩個通道的激發光源之間夾角為120°，通過相位開關控制激發光源各個通道交替工作，激發光源完成平臺基因芯片各通道的熒光激發。

圖3 各通道激發光源對應波譜分布Fig. 3 Spectral distribution of excitation light sources corresponding to each channel

1.3 系統的設計目標

為了解決dPCR以LED作為熒光激發光源的系統中功率小、系統自動化程度低、熒光檢測光學設備復雜等問題，在研究過程中以半波寬（FWHM）小于10 nm的窄帶LED作為系統激發光源。系統通過DC-DC轉換電路設計實現整個工作電源的供給，電路的設計最大電流達8 A，各自獨立通道的熒光激發光源功率可進行獨立調節。其中FAM激發光源電路工作電流為350 mA，整個電路可調節最大功率為3 W；HEX激發光源電路工作電流為350 mA，整個電路可調節最大功率為 3W；ROX激發光源電路工作電流為350 mA，整個電路可調節最大功率為2 W，整個系統激發光源的調節精確度＜1.0%。

圖4 光源系統結構Fig. 4 Structure of light source system

2 系統實現

2.1 控制電路模塊

整個測控系統以STM32F103RET6作為處理器，處理器通過PWM脈沖實現對應通道激發光源LED的調節。整個STM32外圍電路主要由電壓轉換模塊、激發光源控制模塊、LED恒流驅動控制電路模塊等組成。

為了使系統能夠獲得較大功率的恒流穩定電源，系統通過XL4016開關降壓型DC-DC轉換芯片實現整個工作電源的供給。系統轉換電路的設計最大電流達8 A，為提升系統可靠性并對CCD光電系統設備起到保護作用，電路系統以TL431可控精密穩壓源為基礎設計了一套保護電路：當場效應晶體管（MOSFET-P）負載電壓大于12.5 V時晶體管自動斷開，避免因電壓過大造成檢測設備損壞。系統通過微處理器產生的PWM脈沖作用于大功率恒流驅動控制芯片（QX9920）實現整個激發光源系統的調節控制，部分控制系統的電路結構設計如圖5所示。

式中：TD為芯片固定關斷延遲時間，值為61 ns。

LED的輸出電流ILED由電流采樣電阻RCS以及TOFF等參數設定，為

圖5 系統 PWM 調光電路結構設計Fig. 5 PWM dimming circuit design of the system

式中：VLED為LED的正向導通壓降；L1為電感值。在電路設計中為保證系統輸出恒流，在功率電感的選擇時必須保證流過LED的紋波電流值遠小于流過LED通道的電流峰值，即：

式中：VIN為芯片輸入電壓。

2.2 通信模塊

如圖6，整個測控系統的通信設計以PC為上位機，PC對接收到的傳輸數據進行快速分析、處理。系統通過微處理器連接的USB接口實現整個系統與上位機之間的通信。STM32F103-RET6自帶512 kB FLASH，在上位機與下位機通信時間間隔內上位機PC端完成接收數據的處理。串口通信過程中通過上位機與下位機之間數據交互時間間隔、校驗位和波特率等的設置來提升數據傳輸的穩定性和可靠性。

3 系統實現及實驗結果

通過STM32F103RET6微處理器實現整個測控系統的控制，系統中QX9920PWM信號來源于微處理器定時器的三個通道，通過式（1）中電容值的選取，設定光源的關斷時間。整個測控系統以STM32微處理器PA1、PA2、PA3 I/O端口分別作為FAM、HEX、ROX三個通道激發光源的控制信號來源。

經過試驗測試，當系統PWM調光頻率設定為250 Hz時，通過對TIM3_CH1～TIM3_CH3通道PWM占空比設置實現0～255共256個等級的調節控制。圖7為STM32調制出占空比分別80%、70%和60%時的光源驅動電路邏輯分析圖，實驗結果表明系統調節精確度達0.4%。

圖8為使用S1500-M-R（G）-CL CMOS相機進行的基因芯片熒光檢測結果，系統在FAM、HEX、ROX三個通道下調整相機的曝光時間，完成對樣品中三種熒光素對應熒光通道的拍攝。

根據FAM、HEX和ROX熒光通道的檢測結果，S1500-M-R（G）-CL CMOS相機一次曝光可完成HEX通道視野中面積約為11.82 mm×7.88 mm的近3 800個微液滴熒光激發結果的檢測。FAM通道激發源一次可完成9 600個微液滴的熒光激發。圖9（a）中白色亮點處均為dPCR基因芯片HEX通道熒光激發結果成陽性的微液滴。圖（a）中黃色線所在區域樣品點對應灰度值分布直方圖如圖（b）所示，通過灰度分布直方圖中峰值對比分析能準確辨別各熒光激發結果為陽性的微液滴位置分布。灰度值分布圖的生成和應用能夠為后期的光電系統檢測、目的基因識別提供精準的樣本信息。

圖6 系統通信組織架構Fig. 6 System communication structure

圖7 光源驅動電路邏輯分析圖Fig. 7 Logic analysis diagram of light source driving circuit

圖8 各通道熒光檢測結果成像Fig. 8 Imaging of fluorescence detection results of each channel

圖9 熒光激發效果檢測Fig. 9 Detection of fluorescence excitation

4 結 論

本文基于STM32微處理器設計了一套高通量dPCR基因芯片熒光激發測控系統，該系統選取窄帶LED作為激發光源，FAM、HEX和ROX互相獨立的熒光激發通道設計簡化了PCR反應產物熒光激發結果的繁瑣分析過程。系統激發光源部分最大輸出電流可達8 A，調節精確度達0.4%，最大輸出功率3 W。測試實驗結果表明系統一次可實現dPCR基因芯片9 600個微液滴的熒光激發，滿足dPCR基因芯片的高通量和熒光激發的設計需求。該系統具有多個獨立激發通道、單通道LED激發功率大、激發功率可調節、系統熱穩定性好、檢測結果精準等顯著優點，該系統的成功實現可為dPCR基因芯片領域工作人員節省大量時間成本和人力成本。

此外，本設計系統中，基于STM32微處理器的系統功能仍有許多可以拓展的地方。如利用STM32的強大功能提升整個熒光激發系統智能化程度，同時系統可以采用無線通信的方式，以此為基礎開發出便攜式的基因芯片使用設備，進而擴寬dPCR基因芯片技術的實際應用領域。