耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌毒力基因檢測及藥敏分析

鄒佳賀,劉效伊,席健峰，徐 義,王 勇*

(1.佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003；2.深圳市龍崗區婦幼保健院，廣東 深圳 518172；3.云臺山風景名勝區云臺街道衛生院，江蘇 連云港 222000)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)屬于革蘭氏陰性桿菌，近年來已成為引起社區獲得性感染和醫院感染最重要的病原菌之一，可導致呼吸道、泌尿道、傷口等部位的感染及敗血癥、肝膿腫等疾病。碳青霉烯類抗菌藥物是活性最強、抗菌譜最廣的非典型β-內酰胺類抗菌藥物，常被認為是治療革蘭陰性桿菌引起感染的最后一道防線[1]。近年來，由于碳青霉烯類抗菌藥物的大量使用，導致了耐碳青霉烯類腸桿菌的出現(CRE)。收集2018年6月到2019年6月我院分離出的CRKP菌株42株,檢測其毒力基因并對其藥敏結果進行分析。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

收集2018年6月至2019年6月佳木斯大學附屬第一醫院從患者標本中分離出的CRE菌株，去除同一患者不同部位相同的菌株共41株。

1.2 儀器與試劑

Vitek-2 Compact全自動微生物分析儀(法國梅里埃公司)。血平板、麥康凱平板(OXOID公司)。

1.3 標準質控菌株

肺炎克雷伯菌ATCC700603購自國家衛生計生委臨床檢驗中心。

1.4 拉絲試驗

CRE菌株接種在含5%羊血瓊脂平板上，培養18～20h，然后用接種針輕輕挑起菌落，如果挑起菌落過程中出現絲狀物并且≥5mm，則為拉絲試驗陽性；反之，絲狀物長度<5cm則為陰性[2]。

1.5 PCR檢測毒力基因

用磁珠法提取細菌的模板DNA，根據文獻[3-5]委托上海生工生物技術公司合成毒力基因magA、uge、kfu、allS、iroNB、mrkD、kpn、fimH，陽性產物送上海生工生物有限公司測序，結果在NCBI網站上運用BLAST比對確定其基因型(表1)。

表1 毒力相關基因引物序列

表1(續)

1.6 統計分析

數據使用SPSS 22.0 ，Fisher精確檢驗進行統計分析，計數資料采用X2檢驗,以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRKP的臨床科室分布

42株CRKP中有32(76.2%)株是ESBL陽性菌，10(23.8%)株是ESBL陰性的菌。ESBL陽性菌主要見于重癥醫學科和神經外科，ESBL陰性菌主要見于重癥醫學科，見表2。

表2 ESBL陽性菌和ESBL陰性菌科室分布

2.2 CRKP拉絲試驗結果

對佳木斯大學附屬第一醫院42株CRKP進行拉絲實驗，結果皆為陰性。

2.3 CRKP毒力基因攜帶情況

(M：表示mark 1、泳道是uge 2、泳道是fimH 3、泳道是mrkD 4泳道是kpn)

使用PCR方法檢測我院42株CRKP，結果42株CRKP經PCR檢測fimH攜帶率為88.1%(37/42)，mrkD攜帶率為92.9%(39/42)，kpn攜帶率為92.9%(39/42)；所有菌株均攜帶uge基因；magA,kfu,iroNB，alls均未檢出，見圖1。

2.4 CRKP藥敏結果

42株CRKP對臨常用的抑菌藥物如阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢呋新、頭孢呋辛酯、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、厄他培南、亞胺培南、左旋氧氟沙星、復方新諾明等耐藥性顯著。對阿米卡星敏感性達100%。以下是 ESBL陽性CRKP菌株和ESBL陰性菌株耐藥情況，見表3。

表3 ESBL陽性CRKP菌株和ESBL陰性菌株耐藥結果

表3(續)

3 討論

耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌(carbapenem-resistantenterobacteriaceae，CRKP)是一種對頭孢菌素類、青霉素類甚至是碳青霉烯類抗生素廣泛耐藥的多重耐藥菌，目前CRKP僅對替加環素、多粘菌素敏感。研究表明SARS死亡率為11%，而CRKP感染患者死亡率可達40%～50%[6]，感染CRKP的血液病患者死亡率甚至高達60%以上[7]，被稱為超級耐藥菌。由于替加環素在國內還未上市，多粘菌素有很強的毒副作用，應用范圍狹窄，CRKP已處于無藥可治狀態。中國細菌耐藥性監測(CHINT)發布報告指出KP對亞胺培南的耐藥率由2005年的3%，到2010年的9.2%，再到2016年16.1%，可以看出CRKP成明顯增長趨勢，且不同地區細菌耐藥情況存在差異[8]。由于本地區醫院尚未使用阿米卡星這種抗菌藥物，所以對阿米卡星敏感性達到100%。腸桿菌科細菌對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的主要耐藥機制之一是產生超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases，ESBLs)。ESBLs能水解青霉素類、頭孢菌素(包含第三代、第四代頭孢菌素)及單環酰胺類，如氨曲南，并且可以被β-內酰胺酶抑制劑抑制的由質粒介導的一類β-內酰胺酶。ESBLs主要見于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，也見于腸桿菌屬、變形桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬、沙雷菌屬等其他腸桿菌科細菌。近年隨著抗菌藥物大量使用，特別是第三代頭孢菌素的廣泛使用往往是促使產ESBLs菌株出現及廣泛播散的主要原因，各種腸桿菌科細菌甚至都出現了對碳青霉烯耐藥的菌株，表現出多重耐藥。多重耐藥形成的機制比較復雜，主要與產生ESBLs、AmpC酶、碳青霉烯酶等各種重要的滅活酶以及細菌外排系統過度表達、膜通透性改變等機制有關。它們常因攜帶多種不同的耐藥基因而具有多重耐藥性，這種耐藥性可以通過質粒、轉座子等可移動元件在細菌的種內或是種間傳播，造成感染爆發流行，控制產酶菌株的流行防止耐藥菌譜近一步擴大，已經成為減緩耐藥菌眾多措施中的重中之重。

CRKP存在高致死率，但它們的毒力因子特征還尚不清楚。Ⅰ型和Ⅲ型菌毛被認為與KP的粘附有關，是另一類較為重要的毒力基因。Ⅰ型菌毛是細菌表面上的線狀突起，由fimA-H基因編碼。Ⅲ型菌毛是螺旋狀的細絲，在KP中由mrkABCD基因簇編碼。有研究顯示，KP利用環境因素來調節Ⅰ型菌毛的表達，Ⅰ型菌毛在泌尿道中表達，但不在胃腸道或肺中表達，有助于編碼Ⅰ型菌毛的hvKP在泌尿道的粘附，引起尿道炎和膀胱[9]。Hornick稱Ⅲ型菌毛可以通過mrkD基因介導體外物質與氣管、口腔細胞和肺組織結合[10]，這與呼吸機相關性肺炎分離的標本中均能檢出mrkD基因有關。有研究稱無論是hvKP還是cKP都存在Ⅰ型和Ⅲ型菌毛，但也有mrkD基因只在hvKP中檢出，并與K2血清型密切相關的報道[11]。究竟編碼Ⅰ型和Ⅲ型菌毛的基因是否在特定的KP中檢出，需要進一步的研究。根據毒力基因攜帶情況可知我院的CRKP毒力基因目前只發現了四種。

4 結論

綜上所述，應該更加注重對CRKP的耐藥性和毒力基因的檢測，從而促使臨床醫生更好的認識和了解CRKP。