紫草中抗腫瘤物質的篩選及其機制研究

喬媛媛 張文明

成都鐵路衛生學校 四川 成都 611741

紫草始載于《神農本草經》,歷代諸家本草均有詳細記載。其性寒,味甘、咸,歸心、肝經,具有止血涼血之功效,用于治療血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、熱病斑疹、濕疹、尿血、血淋、血痢、熱結便秘、瘡瘍、丹毒、燒傷、惡瘡、癬等[1-2]。現代的研究中,發現它含多種萘醌類化合物——紫草素及其衍生物,是目前為止研究抗腫瘤活性主要成分。由于惡性腫瘤的高發病率和高死亡率,天然藥物紫草活性成分的抗腫瘤作用越來越受到醫學研究者的廣泛關注,正成為當前研究的一個熱點。本文通過對紫草系列化合物的抗腫瘤活性的篩選,并對其抑瘤機制進行探討,為抗腫瘤新藥的研發提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物 紫草(ZC)系列化合物(ZC-10、ZC-11、ZC-12、ZC-13、ZC-14、ZC-15、ZC-16、ZC-17、ZC-20-1、ZC-20-2、ZC-20-3、ZC-21、ZC-22-1),純度98%以上,由中國科學院成都生物研究所提供。

1.2 實驗細胞 人骨肉瘤細胞MG-63,由西南交通大學材料學院屈樹新老師實驗室提供。

1.3 實驗試劑 DMEM 高糖培養基(Hy Clone公司);胰蛋白酶(Hy-Clone公司);胎牛血清(上海復蒙基因生物科技有限公司);二甲基亞砜(DMSO)(美國Amresco公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT)(美國Amresco公司);順鉑(美國Sig ma公司,p4394);青鏈霉素鏈霉素混合液(Beyoti me);PBS(北京中杉金橋生物技術有限公司);Annexin V,FITC凋亡檢測試劑盒(日本同仁化學研究所);人Bcl-2相關X蛋白ELISA Kit(美國RD公司);人B細胞淋巴因子2 ELISA Kit(美國RD公司)。

1.4 主要儀器 HR40-ⅡA2生物安全柜(Haier);倒置相差顯微鏡(OLYMPUS);CO2恒溫孵箱(ESCO);離心機(Heraeus);Accuri C6流式細胞儀(美國BD公司);Elx-800型全自動酶標儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)。

2 實驗方法

2.1 樣品篩選及其IC50的檢測 取對數生長期MG-63細胞,按1×105個/mL的標準分別接種到96孔培養板,200 ml/孔。24小時后加入藥品,分順鉑組、DMEM 組和樣品組,除空白組加入等體積的DMEM 培養基,其余濃度調制均50μg/mL。繼續培養24 h,用MTT法,測定各孔的OD490

將效果明顯的樣品稀釋成5個濃度組：50μg/mL、10μg/mL、2μg/mL、0.4μg/mL、0.08μg/mL,用同樣的方法測定其抑制率,并計算其IC50。

2.2 細胞凋亡實驗(Annexin V-FITC/PI雙染) 同樣方法將MG-63分別接種到6 孔培養板,培養24 h后,然后進行加藥,濃度梯度采取50μg/mL、10μg/mL、2μg/mL,陽性組順鉑濃度是50μg/mL。24h后,開始收集細胞,向收集好的細胞里邊加入500uL 稀釋過后的Annexin V Binding Buffer。然后依次加5uL Annexin V FITC 結合物和5uL PI。溫室下避光15 min,再加入400u LAnnexin V Binding Buffer,1h內上機檢測。

2.3 Elisa法檢測細胞中Bax與Bcl-2蛋白的表達 前面步驟跟2.2步驟一樣,將細胞吸入到EP管中,然后按物理的方法將細胞進行反復凍融裂解,直至細胞完全破裂釋放細胞內成分為止,3000r離心20 min,收集上清液。其他步驟按試劑盒說明書進行操作。計算結果用Bcl-2/Bax的形式表示。

3 實驗結果

3.1 ZC系列化合物的篩選及IC50的檢測 圖1我們可以看出ZC系類化合物均對MG-63有較強的抑制作用,以順鉑作為參照,與DMSO組相比有顯著差異(P＜0.05)。

圖1 ZC系列化合物初篩MG-63

ZC系列化合物對MG-63有較高的抗腫瘤活性,進一步檢測樣品IC50值,其中ZC-10、ZC-14、ZC-15、ZC-17、ZC-20-1、ZC-20-2、ZC-20-3、ZC-22-1的IC50為7.073μg/mL、9.568μg/mL、6.875μg/mL、5.465μg/mL、5.203μg/mL、9.449μg/mL、7.677μg/mL、2.696μg/mL,順鉑的IC50為16.592μg/mL。ZC-17

為單一化合物,純度相對較高,其IC50為5.465μg/mL;其他化合物純度較低,故不做后續實驗。同時經鑒定ZC-17為紫草呋喃A(圖3)

圖3 紫草呋喃A化學結構

3.2 ZC-17誘導細胞凋亡的檢測 由圖4可以看出,順鉑能誘導MG-63凋亡,凋亡率在22.1%,而DMSO 對細胞有較小的影響凋亡在5%附近。另外,ZC-17也能誘導MG-63細胞凋亡,在濃度為50μg/mL、10μg/mL、2μg/mL時,凋亡率分別23%、15.5%、13%,凋亡率同濃度成正相關。

圖4 ZC-17對MG-63作用散點圖

3.3 ZC-17作用MG-63細胞對bax和bcl-2的影響 從表2可以發現,順鉑作用于MG-63在濃度為50μg/mL時,能明顯降低Bcl-2/Bax比值,與空白組對比有顯著差異(P＜0.05);ZC-17在濃度為50μg/mL 時,能降低MG-63細胞Bcl-2/Bax比值,具有統計意義(P＜0.05);而ZC-17在濃度為10μg/mL、2μg/mLL時,與空白組Bcl-2/Bax比值對比,無明顯變化(P＞0.05)。提示ZC-17高濃度可以降低MG-63細胞Bcl-2/Bax的比值。

表 ZC-17作用對MG-63細胞Bcl-2/Bax影響(s,%)

表 ZC-17作用對MG-63細胞Bcl-2/Bax影響(s,%)

注：與DMSO比較,*P＜0.05。

4 討論

紫草作為傳統中藥材,其應用歷史悠久,作用廣泛。近年來,人們在紫草化學成分及藥理作用方面的研究取得了一定成果并逐步深入,其中以紫草提取物以及以此為先導化合物合成的抗癌藥物體外抗癌作用的研究報道最引人注目。

細胞凋亡(Apoptosis)是能量依賴的細胞內死亡程序活化而致的細胞“自殺”是由基因控制的細胞自主有序的主動死亡過程。1972年由Kerr等首次提出細胞凋亡的概念,從此開啟了對細胞凋亡的探索之路。細胞凋亡的信號轉導機制十分復雜。目前認為至少有3條通路參與：即線粒體通路、死亡受體通路和內質網通路,其中以線粒體通路最為經典。Bcl-2家族控制著線粒體外膜和內膜的通透性,因此是線粒體凋亡途徑的主要調控者,它們通過激活一系列下游基因發揮調節凋亡作用[3]。Bcl-2家族分為3類：促凋亡蛋白(如Bak和Bax)、抗凋亡蛋白(如Bcl-2和Bcl-x L)以及Bi m、Bid等BH3-only蛋白。促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白共同作用導致細胞凋亡結果。本實驗采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術法測定ZC-17能引起細胞凋亡,且凋亡率與濃度正相關;同時,用Elisa法測定細胞中bcl-2、bax表達量,發現ZC-17能降低bcl-2/bax。因此可推斷ZC-17誘導細胞凋亡是通過上調bax和下調bcl-2。

綜上所知,紫草系列化合物有抗腫瘤作用,ZC-17能促進細胞凋亡,并且凋亡機制可能跟線粒體通路有關,通過上調bax和下調bcl-2來介導細胞凋亡。