非洲豬瘟檢測技術研究進展

唐 迪，劉 迪，劉 林，王 眾，鄭 寧，鄭業魯

（廣東廣墾畜牧工程研究院有限公司，廣東 廣州 510640）

非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Viruses，ASFV）引起的高發病率和死亡率的傳染病。ASFV是非洲豬瘟相關病毒科的唯一成員，為雙鏈DNA病毒，根據毒株的不同，基因組大小為170～190 kb，有 151～167 個開放性閱讀框[1]。目前基于病毒主要衣殼蛋白p72可將ASFV分為24個基因型，基于病毒血凝素CD2樣蛋白（CD2V）和C型凝集素將病毒分為8個血清群，但僅有1個血清型[2]。目前我國流行毒株為基因Ⅱ型血清8 群[3]。

ASF潛伏期為4～19 d不等，潛伏期長短主要取決于病毒毒力、宿主狀態及感染方式，高毒力毒株的致死率可達100%且各年齡段豬只都易感。世界動物衛生組織（Office International des Epizooties，OIE）將ASF列為法定上報疫病，我國將其列為一類動物疫病。Zhao等[3]用分離的Pig/HLJ/18毒株感染SPF豬，豬只出現發燒（超過41℃），食欲不振，嗜睡，耳緣、尾巴和四肢末端皮膚發紅，呼吸困難和嘔吐等癥狀，這與豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬丹毒、豬皮炎腎病綜合征等疾病的癥狀相似，難以從臨床癥狀直接判斷區分，需借助實驗室檢測手段來確診。ASF感染豬只的唾液、淚液、鼻腔分泌物、尿液、糞便等都可含有病毒，尤其血液中含有大量病毒，可采集相關樣品進行實驗室檢測。

ASFV對豬及豬產品、食品安全有重要的社會和經濟影響，尤其是在以豬肉制品為主要蛋白質來源的國家。1921年ASF被首次報道，之后主要流行于撒哈拉以南的非洲地區。2007年ASF在格魯吉亞暴發[4]，疫情迅速蔓延至整個高加索和俄羅斯地區。2014年ASF傳入東歐大部分國家并初步呈現出擴大流行趨勢[5]。我國生豬養殖體量大，自2018年8月初首次報道非洲豬瘟疫情以來，截至2019年7月3日，我國共發生非洲豬瘟疫情143起，撲殺生豬116萬余頭。ASF在周邊的蒙古、越南、柬埔寨、老撾、朝鮮、韓國等地均有發生，防控形勢十分嚴峻。由于病毒本身的復雜性及對毒力因子和相關保護基因的了解不足，暫無有效疫苗用于ASF防控，因此豬場生存需依賴嚴格的生物安全措施和準確快速的實驗室檢測。本綜述從分子生物學和免疫學兩方面介紹了ASF檢測技術進展，以期為不同條件下檢測方法的選擇提供參考。

1 分子生物學檢測

分子生物學方法主要是檢測病毒核酸，核酸檢測是針對病原體本身采取的檢測方法，能作為診斷ASFV感染潛伏期、急性期或病程初期的有效手段。在ASFV最急性和急性感染中，豬通常在抗體轉為陽性前已死亡，因此抗體檢測更適用于亞急性和慢性感染豬只。常見的分子生物學檢測方法及其優缺點見表1，檢測人員可以根據臨床發病情況及實驗室檢測條件來選擇不同的核酸檢測方法，如現場快速診斷可采用等溫擴增技術，鑒別診斷可采用聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）或熒光定量PCR。

1.1 普通PCR

PCR已成功應用于豬樣品（血液、組織、口腔液等）和鈍緣軟蜱中ASFV基因組的檢測，病毒的核酸片段通過PCR指數級擴增獲得足以檢測的量，從而實現檢測。Luo等[6]根據GenBank中所有ASFV毒株的VP72基因序列的高度保守區域設計特異性引物，建立PCR方法，分析檢測極限是每反應60個核酸拷貝，同時與豬其他幾種重要病原無交叉反應。當檢測來自不同區域的4種基因型（Ⅰ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅸ）的14株ASFV毒株時，新的PCR方法比兩種OIE推薦的PCR方法更靈敏。新的PCR檢測從烏干達收集的62份臨床血樣，與基于超靈敏通用探針庫的熒光定量PCR表現出了很高的一致性（59/62）。相比于其他的抗原檢測技術，如酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA）和直接熒光抗體技術，PCR方法具有更高的敏感性和特異性。

表1 常用分子生物學檢測方法比較Table1 Comparison of frequently-used molecular biology detection technologies

1.2 熒光定量PCR（RT-PCR）

RT-PCR因其高敏感性和特異性，已開發很多穩定成熟的商業化產品，并在各專業實驗室和基層檢測實驗室得到廣泛應用。2019年6月農業農村部公布了第二批非洲豬瘟現場快速檢測試劑名單，包括26個單位的34種產品，其中80%以上都為熒光定量PCR類，引物和探針都是根據病毒基因組中高保守區域VP72設計。

ASF和豬瘟及其他高熱病僅從臨床癥狀上難以區分，多重熒光定量PCR能實現多種病原同時檢測，用于臨床疾病的鑒別診斷，縮減檢測成本。王建華等[7]根據ASFVCP530R基因、豬瘟病毒5'UTR基因和高致病性藍耳病NSP2基因，分別設計了3對特異性引物和Taq Man水解探針，建立了多重熒光定量PCR方法，并對其反應條件進行優化。該方法對ASFV的最低檢出量為每微升61拷貝。有研究者將懸浮陣列系統、自動電子微陣列分析、GenomeLab基因表達譜（GeXP）分析等方法與熒光PCR技術結合，能一次檢測7種豬常見病原，極大提高了檢測效率，但檢測的敏感性有待提高[8-10]。RT-PCR方法敏感性高，檢測過程中需規范操作，否則易出現污染，干擾檢測結果。

1.3 數字PCR

微滴數字PCR（ddPCR）是近年興起的一種新的絕對定量技術，通過極度稀釋實現理論上的單分子擴增，然后利用PCR和泊松分布計算出樣品的原始濃度，ddPCR是繼普通PCR、RT-PCR之后的第三代PCR技術。

鄔旭龍等[11]針對ASFVK205R基因設計了1對特異性引物和Taq Man探針，通過反應條件優化，建立了ASFV ddPCR檢測方法，該方法最低檢測限度可達到0.36拷貝，在20μL反應體系中約為10拷貝/反應，檢測靈敏度是RT-PCR的10倍。原霖等[12]建立ddPCR方法的最低檢測限可達每微升0.8拷貝，敏感性高于RT-PCR方法。但目前ddPCR檢測成本較RT-PCR高。

1.4 等溫擴增技術

等溫擴增技術無需反復的熱循環和精密的儀器，只需要恒溫裝置（如水浴鍋）就能進行快速高效的擴增反應。該技術自出現以來就得到了迅猛發展，有望成為未來檢測發展的新趨勢。等溫擴增技術檢測ASFV操作簡便，對檢測儀器的要求低，反應時間短，有自身特有的優勢，但因缺乏熱循環過程中變性、退火等程序，檢測過程中易出現假陽性，因此僅適用于田間疾病初步篩查，這在一定程度上限制了等溫擴增技術的應用。目前相關檢測試劑盒中酶的成本較高，單個樣品檢測費用較普通熒光PCR高。

1.4.1 環介導等溫擴增技術（Loop mediated isothermal amplification，LAMP） LAMP是Notomi等[13]于2000年首先提出的一種新型的等溫核酸擴增技術，該法使用4條引物（外引物F3/B3、內引物FIP/BIP）來識別6個特異性DNA結合位點，以及鏈置換功能的Bst DNA聚合酶來實現核酸的擴增檢測。田純見等[14]利用ASFV高度保守的非結構DNA聚合酶G1211R基因制備質粒標準品，建立實時熒光LAMP方法，以ASFV E70株病毒核酸為模板，LAMP檢測靈敏度達到21 pg。James等[15]針對ASFV拓撲異構酶Ⅱ基因建立LAMP方法，分析靈敏度能達到330個基因組拷貝，并且能夠檢測多個ASFV的代表性分離株而不與CSFV交叉反應。檢測實驗感染ASFV（馬拉維分離株）的豬只的血液和組織樣品顯示，LAMP測定和RT-PCR之間具有良好的一致性。除了使用瓊脂糖凝膠或RT-PCR機器檢測反應產物外，還可以使用新型側向流動裝置檢測生物素和熒光素雙標記的ASFV LAMP擴增子。

1.4.2 重組酶介導核酸擴增技術（Recombinaseaid amplification，RAA） RAA利用37℃恒溫，將從細菌或真菌中獲得的重組酶與引物DNA緊密結合，形成酶和引物的聚合體，當引物在模板DNA上搜索到與之完全互補的序列時，在單鏈DNA結合蛋白（Single- stranded DNA binding，SSB）的幫助下使模板 DNA解鏈，并在DNA聚合酶的作用下形成新的DNA互補鏈，擴增產物以指數級增長[16]。

農業農村部公布的第二批非洲豬瘟現場快速檢測試劑盒名單中有兩款熒光RAA檢測試劑盒，分別來自中國農業科學院蘭州獸醫研究所和廣州悅洋生物技術有限公司。其中前者的RAA檢測試劑盒采用凍干工藝，制備RAA酶混合干粉，從DNA快速提取到RAA快速檢測可在30 min內完成。若陰性對照無Ct值且無擴增曲線，陽性對照Ct值＜30有對數擴增曲線，為有效結果；在結果有效的前提下，待檢樣品有對數擴增曲線，且Ct值≤35，判定為非洲豬瘟病毒核酸陽性；若Ct值＞39或無數值，則判為陰性；若35＜Ct值≤39，則為可疑樣品，需對樣品重新檢測，如仍為可疑，則判為陽性，否則為陰性。目前已有RAA法檢測塞內卡病毒、沙門菌、瘧原蟲等的報道。

1.4.3 重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA） RPA是一種新型的等溫核酸擴增技術，其與RAA原理基本相似，但前者重組酶來自T4噬菌體，后者來源于細菌或真菌，各種酶共同作用取代普通PCR熱循環解鏈過程，從而大大縮短反應時間。實時熒光RPA法結合一個便攜式的等溫擴增儀可在15 min內獲得檢測結果，檢測時間和便利性優于傳統PCR法。目前已有用RPA法檢測A型流感病毒、水泡性口炎等的報道。Miao等[17]利用RPA方法擴增ASFVp72基因，同時結合側流試紙檢測，敏感度為150拷貝/反應，38℃下10 min即可完成檢測，對145個田間樣品進行檢測，結果與RT-PCR檢測結果完全吻合。哈登楚日亞等[18]也針對ASFVp72建立了實時熒光RPA方法，可檢測10個拷貝的DNA分子，與Miao等的方法相比靈敏度提高了10多倍。

1.4.4 交叉引物擴增法（Cross-priming isothermal amplification，CPA） CPA是針對靶基因區域內設計3對特異引物，引物尾端交叉互換序列，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下即可完成核酸擴增反應。Fr?czyk等[19]針對P72基因，利用CPA擴增豬血液中的ASFV，單個樣品中最低能檢測到7.2個拷貝，與官方通用探針文庫（UPL）實時PCR相比，具有相同的靈敏度。Gao等[20]建立了一種CPA-診斷試紙聯用方法，該研究基于p72基因設計引物及探針，兩個探針分別標記生物素和FITC。該方法最低檢測限為200拷貝，對45份非洲疫區臨床全血DNA樣品檢測的結果顯示，該方法與RT-PCR的符合率為 97.8 %（44/45）。

1.4.5 聚合酶交聯螺旋反應（Polymerase crosslinking spiral reaction，PCLSR） PCLSR是一種等溫擴增的新技術，將傳統PCR或RT-PCR的優勢與等溫擴增的的優勢結合在一起。外部引物的5'-末端互補于α-拉特羅毒素的遠端基因，可保護反應的初始步驟。比較LAMP、CPA和PCLSR發現，PCLSR具有更高的診斷特異性。Wo?niakowski等[21]利用聚合酶交聯螺旋反應，針對p72基因設計3種引物，在65℃下反應產生交聯的復雜結構。使用SYBR Green I染料進行凝膠電泳，觀察PCLSR的結果，靈敏度達到每微升720拷貝。試驗結果需將擴增產物開蓋后進行凝膠電泳觀察，氣溶膠污染的可能性大，因此不適合基層實驗室使用。

1.5 其他技術

隨著科技進步，出現了很多新的檢測方法，如液態芯片技術、生物傳感器技術等。Wang等[22]建立了一種液態芯片技術Luminex xMAP，設計針對病原體核酸的特異性探針與引物，將探針與熒光羧化微球偶聯，能同時檢測包括ASFV在內的10種昆蟲傳播的病原體，每個反應能檢測到10個目標基因拷貝。Biagetti等[23]使用生物傳感器檢測血液中的ASFV核酸，利用具有鎖定核酸核苷酸的單鏈DNA探針作為p72基因保守區域的互補識別元件，其能檢測每微升373～1058拷貝范圍內的DNA，在此范圍內該生物傳感器的檢測結果與OIE推薦的RT-PCR檢測結果有極好的相關性。

要獲得檢測的時效性，養殖基地現場檢測很重要，因此研究者也在檢測儀器設備改進、樣品處理調整等方面開展研究，使其更適合于基層檢測要求。Liu等[24]開發了一種雙重實時PCR檢測方法，用于快速檢測和分析ASFV和CSFV，該測定在便攜式電池供電的PCR熱循環儀上進行。張彩虹等[25]根據VP72基因序列建立ASFV的RT-PCR方法，采集的樣品無需提取核酸，可在60 min內完成對樣品的檢測。便攜式熒光PCR儀和核酸免提取技術，為野外或現場的非洲豬瘟病毒快速檢測提供了一種切實可行的方法。

2 免疫學檢測

病毒入侵機體后，機體識別“自身”與“非己”抗原，針對“非己”抗原產生特異性的免疫反應。據報道，ASF的自然感染潛伏期為4～19 d，在臨床癥狀出現2 d前，ASF感染動物開始散播大量病毒，ASFV散播因毒株不同而異。機體感染ASFV后約7～9 d血清轉陽，抗體陽性可持續終生，亞急性及慢性感染豬血液中的帶毒量隨著時間推移會逐漸降低，此時抗體檢測顯示出意義，豬場新引進的種豬除核酸檢測陰性外還需抗體檢測陰性。常用的免疫學方法有紅細胞吸附反應（Haemadsorption，HA）、酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）、免疫層析試紙條法、免疫印跡試驗（Immunoblotting，IB）等，各檢測方法的優缺點比較見表2。

表2 ASFV免疫學檢測方法比較Table2 Comparison of ASFV immunology detection technologies

2.1 HA

HA即在體外培養時受ASFV感染的白細胞周圍吸附豬紅細胞，形成“玫瑰花環”，該法是ASFV特有的檢測技術。Rod rí guez等[26]研究發現，ASFV基因組內一個開放閱讀框EP402R編碼的多肽（該多肽有402個氨基酸殘基，與T細胞粘附受體CD2同源，EP402R的轉錄發生在病毒復制的后期）直接參與血細胞吸附現象。將EP402R內一段長354 bp的片段破壞后，病毒的體外生長速率不受影響，但血細胞吸附現象消失。由于HA的特異性和敏感性，該法可用來評估疑似暴發，特別是當其他檢測為陰性時，應該用HA方法進行確診。需要注意的是，并非所有ASFV都能產生HA。HA因操作復雜，檢測周期長，目前僅在專業實驗室內進行。

2.2 ELISA

ELISA是一種敏感、快速、實惠的檢測技術，尤其適合于流行病學調查、疫病監測與凈化時的自動化血清學檢測。因此，ELISA是目前非洲豬瘟大規模血清學研究最適用的方法，其包括抗原檢測和抗體檢測。

Vidal等[27]利用針對P72的單克隆抗體結合固相夾心ELISA以檢測豬樣品中的P72蛋白，能檢測的最低抗原濃度為0.05μg/mL，低于使用多克隆抗體獲得的0.6μg/mL檢測限。用該方法檢測全病毒顆粒的敏感性為2.3×102PFU/ mL。Gim é nez-lirola等[28]選定 p30 作為間接 ELISA中使用的重組蛋白，能夠檢測血清或口腔液樣本中的ASFV抗體。實驗條件下對豬只接種ASFV，8～12 d后采用優化的ELISA方法可從采集的豬血清和口腔液樣品（血清樣品以1∶100稀釋，口腔液樣品以1∶2稀釋）中檢測到抗p30抗體。對非疫區豬群的血清（n= 200）和口腔液（n= 200）田間樣品的測試表明，該方法具有高度特異性。

然而，由于血清成分復雜及缺乏特異性試劑等原因導致ELISA經常出現假陽性或假陰性，尤其當樣品處理或保存不當，如溶血樣品可能產生高達20%的假陽性結果，故通過ELISA檢測為陽性的可疑樣品須通過其他血清學替代試驗確認，如IB。

2.3 免疫層析試紙條法

免疫層析技術是一種固相免疫標記技術，具有操作簡單，反應靈敏迅速，結果判定直觀，無需特殊設備和專業人員等優點。較經典的即時檢測主要以膠體金作為標記物，以檢測線和質控線顯色情況及深淺進行定性及半定量檢測，不能實現完全定量。吳海濤等[29]利用膠體金標記的ASFV P72蛋白單克隆抗體包被硝酸纖維素膜，以識別兩種原核表達的P72蛋白，對兩種抗原的最低識別量分別為15、21 ng，經測試該試紙條的特異性、敏感性、穩定性表現良好。張鑫宇等[30]建立ASFV p54抗體的膠體金檢測方法，該試紙條的敏感性為200 ng/mL，可在5～10 min內判定試驗結果。對141份豬血清樣品進行對比檢測表明，在ASFV感染早期，膠體金試紙優于OIE推薦的間接ELISA檢測方法；以Western Blot檢測方法作為參照，該試紙條檢測疫區陽性樣品的符合率比ELISA高。Sastre等[31]開發了用于抗原檢測的側向流動測定（Lateral flow assay，LFA），將針對VP72蛋白的單克隆抗體與黑色乳膠珠共價結合，可在10 min內判定結果。測定血液中抗體的靈敏度為3 ng，與市售的雙抗體夾心ELISA相當。當使用組織培養病毒進行測試時，檢測限低至104PFU/mL。LFA的靈敏度低于RT-PCR，在檢測田間樣品時假陰性比例高。有研究者利用試紙條法實現多種病原抗體同時檢測，Sastre等[32]利用雙重側向流動法，將VP72蛋白和CSFV的E2蛋白與不同顏色乳膠微球耦合，可同時檢測血液樣品中的ASFV和CSFV抗體。

新型試紙檢測技術向著多靶標、高敏感性檢測等方向發展，出現用于提高試紙敏感性的新材料，如量子點、磁顆粒、熒光微球等。量子點又稱作納米晶，相對于傳統的有機染料，量子點標記材料具有更好的光穩定性、窄且對稱的發射光譜、高的發光強度及更長的熒光壽命。林彥星等[33]將ASFV VP73蛋白的抗原性多肽作為試紙條檢測線的包被抗原，采用量子點作為標記材料對葡萄球菌蛋白A（SPA）進行標記，以抗SPA的多克隆抗體作為質控線的包被蛋白，制備快速檢測ASFV抗體的量子點免疫層析試紙條。結果表明，所制備的試紙條與常見相關豬疫病陽性血清無交叉反應，與進口ELISA試劑盒對臨床樣品的檢測符合率為100%。

試紙條法檢測結果容易受到樣品質量的影響，如樣品來自死亡或者捕殺動物的尸體，或血液樣品出現溶血等都會導致結果不準確，因此試紙條法僅適用于檢測條件缺乏地區的ASF初步篩查。

2.4 IB

IB技術適用于蛋白質檢測和鑒定。該技術快速、靈敏，其原理是抗原抗體的特異性結合，操作相對復雜，適合于專業檢測實驗室使用。當血清樣品疑似保存較差時推薦使用這種方法。ASFV感染動物后會刺激機體產生針對多種病毒蛋白的抗體，可通過IB試驗檢測到。Kazakova等[34]使用高度純化的重組p30蛋白開發免疫印跡試驗系統（Rec p30-IB），Rec p30-IB測試結果顯示，該方法的診斷特異性和靈敏度分別為98.75%和100.00%，可用于免疫系統器官樣本及血清中ASFV的特異性抗體檢測。

Alcaraz等[35]利用大腸桿菌表達p54蛋白建立了ASFV的IB檢測技術，證實ELISA檢測ASFV特異性抗體中獲得的陽性結果。重組蛋白質印跡試驗是高度特異性的，并且對ASFV感染的豬只檢測同樣敏感，新的蛋白質印跡試驗消除了常規技術使用抗原中含細胞化合物產生的假陽性反應的可能性，并且避免了在抗原生產中使用活病毒。

3 討論

由于ASF尚無可用疫苗，ASFV抗體陽性即表明現在或曾經發生了感染。此外，ASFV抗體在感染早期即可出現并可持續數年。然而，在最急性和急性感染中，豬通常在抗體轉為陽性前已死亡。因此，在疫病暴發的早期階段，建議采集樣品檢測病毒核酸或抗原。但隨著一種疾病在某地的長時間流行，亞急性感染和耐過豬只增多，此時抗體檢測顯示出意義。

1979—1981年巴西與伊比利半島有3.5%和0.6%的暴發案例源于ASFV感染后耐過轉為血清陽性存活豬只帶毒傳播造成的[36-37]。近年西非坦桑尼亞3.72%豬只感染ASFV后呈現無癥狀但血清陽性，并在1年后導致新的暴發[38]。我國非洲豬瘟的疫情史較短，目前流行的主要是強毒株，但非洲豬瘟短期內在我國較難清除，巴西凈化非洲豬瘟所用時間最短也耗時7年。隨著病毒和宿主的相互適應進化，出現病毒毒力由強到弱也不無可能。在歐洲已有非洲豬瘟基因Ⅱ型病毒株由強毒力轉變為中等毒力的報道[39]，這一轉變表明病毒的致死率降低，臨床癥狀更溫和，豬只出現耐受，長時間后血液帶毒量低，而抗體能在豬體內留存多年甚至可終生存在，檢測時效性更長。未來ASFV疫苗面世后，也可利用抗體監測來反映疫苗免疫效果。

為更好應對非洲豬瘟疫情，農業農村部鼓勵各規模化豬場進行自檢。目前RT-PCR檢測的靈敏度高，在各基層檢測實驗室應用較多。但由于檢測實驗室未嚴格分區，專業檢測人員缺乏，容易發生實驗室氣溶膠污染，導致結果不準或檢測中斷。ASFV檢測在基層的廣泛應用依賴于對病原特性進一步研究，尋找特異性好、靈敏度高且更適用于田間檢測的技術。ASF作為外來動物疫病，使我國養豬業損失慘重，此次災難也促進各地豬場生物安全防控的全面升級改造，從控制傳染源、切斷傳播途徑、保護易感動物等各方面來控制疫情傳播擴散。我們需積極從ASF防控中吸取經驗教訓，采取系統化措施控制外來疫病，穩定畜牧業生產。