EFNA3在結直腸癌中的表達及臨床意義

段 潔，何藝偉，謝 明，楊 沙，陳賢永，周 君，曹慧秋

湘南學院12015級臨床醫學系，2基礎醫學院，3病理研究所，4附屬醫院病理科，湖南 郴州 423000；5郴州市第一人民醫院中心醫院病理科，湖南 郴州 423000

結直腸癌為世界上常見的消化道惡性腫瘤之一，我國結直腸癌的發病率與死亡率呈逐年升高的趨勢[1-3]。結直腸癌容易發生肝臟轉移和腫瘤化療藥物耐藥，預后差[4]。在直腸及直腸與乙狀結腸交界處發病率占60%的比例[5]。Eph家族蛋白包括促紅細胞生成素產生肝細胞受體（Eph）[6]及其細胞表面的配體Ephrin。Ephrin A3（EFNA3）為Eph家族成員之一，是抑制血管再生基因[7]，Eph及Ephrin均屬于膜蛋白，細胞間近距離的接觸可以對其進行活化，同時還參與細胞的信號轉導[8-9]。研究顯示，EFNA3的表達差異與腫瘤的發生發展等存在密切關聯。目前，國內已有關于EFNA3在不同腫瘤中表達情況的研究，且在不同腫瘤中EFNA3的表達情況也有所差異，然眾多研究中并未見EFNA3在結直腸癌中的研究，因此本課題主要探討EFNA3在結直腸癌中表達及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集湘南學院附屬醫院2013～2017年手術切除的結直腸病例進行石蠟切片。其中結直腸癌組織44例，良性結直腸腫瘤組織20例，正常結直腸組織20例。對所選結直腸癌組織進行分組，按照TNM分期標準：Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期26例；按組織學分級：高分化17例，中低分化27例；按有無淋巴轉移：26例有淋巴結轉移，18例無淋巴結轉移。結直腸癌組患者年齡35～99歲（63±14歲），良性結直腸腫瘤組患者年齡22～80歲（55±20歲），正常結直腸組患者年齡29～70歲（51±12歲）。

1.2 主要試劑

EFNA3抗體（Bioworld Technology），羊抗鼠/兔二抗試劑及其他免疫組化試劑（廣州深達公司）。

1.3 實驗方法

石蠟切片，烤片2 h，二甲苯脫蠟20 min，過無水乙醇洗去二甲苯，降濃度梯度酒精清洗，抗原修復，過氧化氫中孵育18 min，PBS洗3次（2 min/次），37 ℃一抗孵育（40 min），PBS洗3次（2 min/次），37 ℃二抗孵育（40 min），PBS洗3次（2 min/次），DAB染色（5～7 min），PBS洗3次（2 min/次），蘇木精染色（6～8 min），沖洗，吹干，樹脂封片。

1.4 半定量評分

采用半定量方法記錄免疫組化結果，高倍鏡下觀察結直腸癌組中的癌巢細胞或正常結直腸組和良性結直腸腫瘤組中的腺上皮細胞，每例標本隨機選取10個鏡頭。對于同一樣本，評分從2個方面進行：（1）將染色強度分為4級，無染色記0，淺染色記1，棕色染色記2，棕褐色染色記3；（2）將陽性細胞百分率分為4級，陽性細胞百分率＜10%記為0，10%～25%記為1，26%～50%記為2，51%～100%記為3。對上述10個鏡頭下的評分結果取均值，以上評分結果均保留兩位小數，將兩個方面的評分累加得到該樣本最終的半定量評分。

1.5 統計學方法

統計學分析利用SPSS 22.0進行，數據均采用均數±標準差表示。EFNA3組間對比采用單因素方差分析，組內對比采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 EFNA3表達于正常結直腸組織，良性結直腸腫瘤和結直腸癌中的情況

EFNA3的表達在結直腸癌，良性結直腸腫瘤與正常結直腸組織中均可檢測到，陽性染色定位于胞漿（呈棕黃色）。EFNA3在結直腸癌組中表達強度低于良性結直腸腫瘤與正常結直腸組，差異有統計學意義（3.6±1.3vs5.1±0.6vs4.9±1.3，P＜0.05），正常結直腸組與良性結直腸腫瘤組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 結直腸癌中EFNA3的表達與臨床病理特點的關系

EFNA3在結直腸癌組織中的表達強度，高分化組中顯著高于中低分化組，差異具有統計學意義（P＜0.05，表1、圖1）；按TNM分期Ⅰ～Ⅱ期顯著高于Ⅲ～Ⅳ期，差異具有統計學意義（P＜0.05）；而在有淋巴轉移組中表達強度顯著低于無淋巴轉移組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 EFNA3的表達與結直腸癌臨床病理特點的關系

圖1 EFNA3在正常結直腸組織（A）、良性結直腸腫瘤（B）和結直腸癌（C）中的表達（×400）

3 討論

EFNA3是一類血管生成抑制因子，存在于胞膜表面。通過與特異性受體結合來介導細胞的信號轉導，進而調節細胞的形態與功能[7-9]。有研究表明EFNA3為miR-210的一個直接作用靶點[10]，低氧條件下miR-210可通過下調EFNA3促進血管新生[11]。有研究在胰腺導管癌進行實驗[15]，敲除EFNA3，結果證實EFNA3通過癌細胞的交叉網絡促進腫瘤細胞的生長，其機制涉及細胞微環境的改變，特別是腫瘤組織新生血管的形成。有研究采用免疫組織化學的方法在卵巢癌中進行實驗[16]，結果顯示EFNA3在上皮性卵巢癌組織與正常卵巢組織中表達存在差異。根據近些年在乳腺癌當中的研究知，EFNA3在乳腺癌的發生發展中具有較為重要的作用，其主要機制是miR-210與靶基因EFNA3的調節。乳腺癌細胞分泌的外泌體組成中包含核酸miR-210，miR-210通過外泌體進入血管內皮細胞，作用于靶基因EFNA3，活化內皮細胞，誘導血管生成因子，從而促進血管的生成[12-14]。因此如果對EFNA3進行深入研究，有望進一步了解結直腸癌的發生、侵襲轉移機制，也能為結直腸癌的治療提供新的靶點。

本研究通過對84例結直腸組織進行免疫組化實驗，統計結果后發現，EFNA3在結直腸癌組低表達，且在低分化，有淋巴結轉移，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期中表達率降低尤為顯著，即可認為EFNA3表達率越低，腫瘤惡性程度越高。且有研究證實，在多種惡性腫瘤如乳腺癌[15]、骨肉瘤[16]、前列腺癌[17-20]、神經膠質瘤[6]中EFNA3低表達，實驗結果與我們的預期相符，EFNA3低表達于結直腸癌組織中。EFNA3隨著癌癥發生過程的逐漸深入而表達遞減，因此我們認為EFNA3可能與結直腸癌的發生過程有關并在其中起到了類似抑癌基因的作用，這一現象可能與結直腸癌組織對EFNA3基因的抑制有關，但具體機制尚不清楚。總之，對EFNA3在結直腸癌中進一步研究，有望對結直腸癌的治療開發一條新的思路。