不同產地菊花黃酮化合物抗氧化活性研究

雷康藤，韓笑笑，龍娟娟，楊琳妹，張毛毛，鈕谷雨，張 培

(滁州學院 材料與化學工程學院，安徽 滁州 239000)

菊花為菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的干燥頭狀花序，具有清熱解毒、平肝明目的作用，可用于治療風熱受寒、頭痛目炫、眼目昏花等病癥[1]。依據其產地和處理方式的不同，菊花具有滁菊、貢菊、亳菊、杭菊、懷菊等多種類型[2-4]。菊花的主要作用成分是黃酮化合物，根據藥理學實驗，黃酮化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎等多種生物活性[5-7]。目前，關于菊花抗氧化活性的研究較多，但關于不同產地菊花黃酮化合物抗氧化活性比較的文章較少，故難以發現其中的規律與黃酮化合物產生功效的作用機制。

為了全面、系統地評價不同產地菊花的質量與其抗氧化活性之間的關系，本實驗從4個不同產地的菊花(亳州、滁州、黃山和杭州)中提取其主要活性成分--黃酮化合物，并對其抗氧化活性(清除羥基自由基能力、清除超氧陰離子自由基能力及還原能力)進行研究，以期為菊花在保健品和食品方面的研究與開發提供基礎資料。

1 試劑和儀器

抗壞血酸(阿拉丁試劑)、鄰菲羅啉(天津市光復精細化工研究所)、無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)、Tris(國藥集團化學試劑有限公司)、蘆丁(中國食品藥品檢定研究)，實驗所用滁菊、亳菊、杭白菊、貢菊均購于滁州華巨百姓緣大藥房。

Cary 100 Scan 紫外可見分光光度計(美國Varian公司)、分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)、烘箱(上海三發科學儀器有限公司)、旋轉蒸發儀(鄭州凱祥儀器設備有限公司)。

2 結果與討論

2.1 黃酮化合物的提取

稱取四種不同產地的菊花各10 g，加入60%乙醇，于60 ℃回流提取2次，每次2 h。合并濾液，減壓蒸餾至一定體積，加入適量水使其呈現混懸的狀態，分別用石油醚、氯仿萃取，得氯仿萃取液，減壓蒸餾，得濃縮液，50 ℃干燥后，即得黃酮類化合物，稱重，計算產率。四種產地菊花(滁菊、亳菊、杭白菊、貢菊)中黃酮的產率依次為：31.2%、34.5%、27.8%和30.9%。由此可知，亳菊的黃酮的提取率最高，杭白菊最低。

2.2 總黃酮含量的測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定四種不同產地菊花黃酮化合物總黃酮含量。

(1)標準曲線的制備

精密稱取蘆丁10.0 mg至 50 mL容量瓶內，用60%乙醇溶解并定容，搖勻，得蘆丁對照品溶液。分別精密移取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 mL蘆丁對照品溶液至7個25 mL容量瓶中，加入5% NaNO2溶液1 mL，靜置5 min后，加入10% Al(NO3)3溶液1 mL，放置6 min，分別加入12% NaOH溶液10 mL，60%乙醇定容，搖勻，反應15 min后，于521 nm處測定吸光度。以蘆丁對照品濃度(X:mg/mL)為橫坐標，吸光度(Y)為縱坐標，建立標準曲線回歸方程為：Y=7.2795X - 0.0008(X: mg/mL，R=0.9988)，溶液在0～0.048 mg/mL范圍內線性良好。

(2)樣品溶液的測定

分別稱取不同產地的菊花黃酮化合物0.8 g左右于10 mL容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容，得樣品溶液。移取樣品溶液1 mL于25 mL容量瓶中，按"標準曲線的制備"操作，處理各樣品，測吸光度。將各樣品吸光度帶入蘆丁標準溶液線性回歸方程中，計算總黃酮含量。四種產地菊花(滁菊、亳菊、杭白菊、貢菊)中黃酮化合物總含量依次為：14.51%、11.84%、12.45%和13.66%。由此可知，滁菊黃酮化合物總黃酮含量最高，亳菊最低。

2.3 黃酮清除羥自由基的測定

分別移取2.00 mL pH值7.4的磷酸鹽緩沖液和2.5 mmol/L鄰二氮菲溶液3.00 mL于10 mL容量瓶中，混勻，加入0.50 mL 15 mmo1/L FeSO4溶液，迅速搖勻；然后再分別加入1.00 mL不同濃度各產地菊花黃酮化合物樣品溶液和1.00 mL 0.1%的H2O2溶液，用去離子水定容到10 mL；未損傷管不需要加樣品溶液和H2O2；損傷管不加樣品溶液；以抗壞血酸作為陽性對照。在37 ℃條件下反應1 h后取出，于510 nm處測吸光度。記錄數據，并按以下公式計算黃酮清除羥自由基能力。

·OH清除率(%)=(A2-A1)/(A0-A1)×100%

式中:A0——未損傷管的吸光度；

A1——損傷管的吸光度；

A2——樣品溶液的吸光度。

實驗結果如圖1所示，不同產地菊花黃酮化合物及抗壞血酸的羥基自由基清除率均隨著濃度的增大而增大，且抗壞血酸的清除率明顯高于各產地的菊花提取物。 當濃度為0.32 mg/mL時，貢菊清除能力相對較高，為65.58%。亳菊、杭白菊、滁菊的清除能力略低，依次為47.07%、42.25%、41.12%。

圖1 四種產地不同濃度菊花黃酮化合物及抗壞血酸對氫氧自由基的去除率

2.4 黃酮清除超氧自由基的測定

分別用移液管移取4.50 mL Tris-HCl緩沖溶液于10 mL的試管中，恒溫預熱20 min(20 ℃水浴)后，分別加入從各產地系列濃度的菊花黃酮化合物樣品溶液1.00 mL以及0.4 mL的25 mmol/L鄰苯三酚溶液，均勻混合；在25 ℃恒溫水浴5 min之后，加入1.00 mL 8 mol/L HCl溶液，使反應停止，于299 nm處測吸光度。其中，空白對照不加樣品液，陽性對照選用抗壞血酸。平行實驗三次。依照下式計算黃酮清除超氧自由基的能力。

式中:A0——未加樣品時鄰苯三酚吸光度；

A1——加樣品后鄰苯三酚吸光度。

實驗結果如圖2所示，不同產地的菊花黃酮化合物均具有一定的清除超氧陰離子自由基的能力，且隨著黃酮化合物濃度的增大而升高。當濃度為0.32mg/mL時，杭白菊清除能力最強，為54.09%，滁菊最弱，為32.36%。

圖2 四種產地不同濃度菊花黃酮化合物對超氧陰離子自由基的清除率

2.5 黃酮還原能力的測定

分別移取2.50 mL各產地系列濃度的菊花黃酮化合物樣品溶液到10 mL容量瓶中，分別加入2.50 mL pH值= 6.6的磷酸緩沖液和2.50 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，均勻混合后，40 ℃保溫15 min，加入2.50 mL 10%三氯乙酸溶液，3000 rpm離心10 min；取上清液5.00 mL，再分別加入去離子水5.00 mL和0.1% FeCl3溶液1.00 mL，于700 nm處測定吸光度，記錄數據。其中，空白對照不加樣品液，陽性對照選用抗壞血酸。平行實驗三次。

實驗結果如圖3所示，滁菊、亳菊、杭白菊和貢菊都具有一定的還原能力，且與菊花黃酮化合物的濃度成正比，但均低于抗壞血酸陽性對照組。四種菊花中，亳菊的還原能力最強，貢菊的還原能力最弱。

圖3 四種產地不同濃度菊花黃酮化合物的還原能力

3 總結

本實驗首先從四種不同產地的菊花中提取黃酮化合物，測定總黃酮含量，并從三個方面(清除羥基自由基、超氧陰離子自由基能力及還原能力)研究四種不同產地菊花中黃酮化合物的抗氧化活性，結果表明，四種菊花中，亳菊黃酮化合物含量最低，滁菊最高。不同產地的菊花黃酮化合物均具有一定的抗氧化活性。