多靶向嵌合抗原受體T細胞在惡性腫瘤中的研究進展*

舒琳倩 李琳 王雪娟 侯宗柳 王曉丹 綜述 廖力微 審校

2018年全球最新癌癥數據統計顯示，中國新增惡性腫瘤病例430 萬例，新增死亡病例290 萬，中國癌癥發病率和死亡率居全球第一［1］。惡性腫瘤治療分為：手術、放療、化療、免疫治療。其中免疫治療有特異性強，不良反應輕等優點。嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）T細胞治療是一種快速發展的免疫治療方法［2］。CAR-T 細胞治療是從癌癥患者中分離出T 細胞，在體外通過基因技術構建CAR，并實現擴增后回輸給患者，CAR-T 細胞直接靶向殺死腫瘤細胞并刺激機體的免疫反應［3］。目前國內外單靶向CAR-T 細胞在血液腫瘤中的治療效果較好，但靶抗原的丟失也是使用單靶向CAR-T細胞治療后腫瘤復發的主要原因之一［4-5］。如抗CD19和CD22的CAR-T 細胞治療后，單靶向CAR 通過靶抗原表面表達的丟失或減少導致腫瘤免疫逃逸［6-7］。然而，多靶向CAR因為能夠同時靶向多個腫瘤抗原從而降低腫瘤免疫逃逸的可能，已用于臨床惡性腫瘤研究。多靶向CAR 包括2 個或2 個以上的單鏈抗體（single chain variable fragment，scFv）區域，其排列成串聯或環狀結構，每個區域針對一個不同的抗原，并且每個抗原有使CAR激活的能力［8］。研究表明，同時針對多種抗原構建的多靶向CAR-T細胞治療可以產生協同效應，并有助于克服因單一可變抗原丟失發生的復發［5］。多靶向CAR-T 細胞治療是最近腫瘤研究的熱點，眾多惡性腫瘤的研究突破均與其相關，它是惡性腫瘤靶向治療的主要方式，也是攻破癌癥復發的關鍵措施之一。

1 多靶向CAR-T的概念及效應機制

多靶向CAR-T 是賦予T 細胞多抗原特異性，允許scFv區域結合2個及以上的特異性腫瘤抗原，并均可觸發完整的CAR 信號并驅動T 細胞活化、增殖和發揮細胞毒活性。目前通過下述4 種方法可實現多靶向CAR-T 的效應機制：①產生2 個或更多表達不同CAR 的細胞群并將其一起或順序地注入體內；②使用雙順反子表達載體，在同一細胞上編碼2個不同CAR；③同時設計2 種不同結構的T 細胞（共轉導），及上述方法①和方法②的相結合，將不同方法產生的雙CAR 同時表達在細胞組成的CAR-T 亞群；④使用單個載體將雙特異性或串聯的CARs 在同一嵌合蛋白上編碼2個CARs［9］。

多靶向CAR-T 中，以雙靶向CAR 最常見。雙靶向CAR 可以根據其識別并結合腫瘤特異性抗原的scFv與CAR的內域連接方式分為以下3種：雙價串聯CAR結構（bivalent“tandem”CAR），雙價環狀CAR結構（bivalent“loop”CAR）和Dual CAR 結構。雙價串聯CAR 是一種功能嵌合抗原受體，是能夠介導T 細胞的雙特異性激活和靶向性的新型人工分子［10］。雙價環狀CAR 結構是在串聯雙靶CAR-T 的基礎上，將分別攜帶2 個靶點的scFv 區在細胞外形成一個環狀結構［5］。Dual CAR 是由2 種不同抗原為靶點在不同單鏈抗體上同時表達形成的兩種CAR，此種結構是通過編碼內部的同一啟動子的相同雙順反子載體形成的序列，從而使兩個CAR 在T 細胞質膜上同時表達，因此有助于同時靶向多種腫瘤抗原，增強治療效果［4，11］。

2 多靶向CAR-T的主要靶點

靶向多個抗原的CAR-T細胞療法是一種有效克服抗原逃逸的策略，其中比較重要的是靶點的類型［8］。目前多靶向CAR-T在血液系統、中樞神經系統、消化系統和胸部等惡性腫瘤中有一定的研究進展。

2.1 多靶向CAR-T 在血液系統惡性腫瘤中的主要靶點

血液惡性腫瘤多靶向CAR-T的主要靶點有：CD19、CD20和CD22（三價CAR-T）［12］；CD20和人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）［13］；CD123和CD19［14］；CD19和CD70［15］；CD19和CD79b［16］；CD13 和T 細胞免疫球蛋白黏液素3（T cell immunoglobulin mucin 3，TIM3）［17］；B細胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）和鈣離子信號調節親環素配體耦合體［18］；BCMA 和CD19［19-20］；BCMA 和CD319［21］。其中抗CD19和抗BCMA多靶向CAR-T在多發性骨髓瘤中療效較好，在臨床前實驗中，首次報道了新型靶點CD19和BCMA的Tan-CAR-T，此種雙靶向CAR-T的細胞增殖、細胞因子釋放和細胞溶解活性能力均與單靶向CAR-T相當，但在體內研究中，對小鼠異種移植模型中表達CD19和BCMA的多發性骨髓瘤生長有特異性的抑制作用，并且有助于降低單靶向CAR-T細胞治療后的復發率［20］。在一項Ⅱ期臨床試驗中，將抗CD19和抗BCMA CAR-T輸入復發或者難治性多發性骨髓瘤的21例患者中，有20例患者對治療有反應，其中有17例患者在隨訪期間（17～602天）無復發和進展［19］。因此，雙靶向CAR-T可能是治療復發性或難治性多發性骨髓瘤的一種有前途的治療方式。此外，關于第4代雙靶向CAR-T的病例報道發現，1例患有原發性中樞神經系統彌漫性大B細胞淋巴瘤的老年患者，在大劑量化療搶救治療失敗后發生第2次復發，免疫組織化學法檢測顯示，組織中的CD19、CD70表達，采用抗CD19和CD70 Dual CAR-T治療，患者在無細胞因子釋放綜合征、CAR-T細胞相關神經毒性或其他嚴重并發癥的情況下生存期超過17個月，在CAR-T細胞輸注321天后仍然可以檢測到抗CD19和CD70 CAR-T細胞［15］。以上研究表明多靶向CAR-T細胞靶向2種及2種以上相關抗原可能是解決難治性疾病或疾病復發問題的一種有希望的策略，并且有延長患者生存期的治療效果。

2.2 多靶向CAR-T 在中樞神經系統惡性腫瘤中的主要靶點

中樞神經系統惡性腫瘤治療效果較好的靶點有：HER2和白介素13受體α2（interleukin-13 receptor α2，IL-13Rα2）［22］、表皮生長因子受體變體Ⅲ（epidermal growth factor receptor variant type Ⅲ，EGFRvⅢ）和表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）［23］。在臨床前模型中，膠質母細胞瘤在單靶向CART細胞治療后，由于抗原變異逃逸，導致腫瘤復發，為了減少抗原逃逸現象發生，提高T細胞的抗腫瘤活性，設計了一個抗HER2 scFv和抗IL13Rα2 scFv靶點串聯組成的CAR外域（TanCAR），TanCARs通過誘導HER2-IL13Rα2異二聚體與HER2和IL13Rα2同時結合，當這2種抗原同時出現時，促進了T細胞活化。這種活化的T細胞比聯合表達抗HER2-CAR和抗IL13Rα2-CAR的T細胞、聯合表達非特異性CAR-T細胞或聯合表達產物的T細胞更持久且不易耗盡［22］。此外，在動物模型實驗中，EGFRvⅢ和EGFR構成的雙特異性CAR-T細胞治療陽性的EGFRvⅢ的膠質母細胞腫瘤小鼠模型，所有小鼠均有持久的應答反應［23］。此外，已有研究證明抗EGFR CAR-T細胞治療腫瘤的主要不良反應是皮膚毒性［24］，但是在人體皮膚移植的小鼠模型中，雙特異性CART細胞治療后無證據表明對皮膚模型有毒性［23］。

2.3 多靶向CAR-T 在消化系統惡性腫瘤和胸部惡性腫瘤中的主要靶點

消化系統惡性腫瘤治療效果較好的靶點是：人滋養層細胞表面抗原2（trophoblast cell surface antigen 2，Trop2）和細胞程序性死亡配體1（programmed cell deathligand 1，PD-L1）［25］、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和間皮素（mesothelin，MSLN）［26］。胸部惡性腫瘤治療效果較好的靶點：纖維細胞活化蛋白（fibroblast activating protein，FAP）和單克隆抗體F19［27］。Trop2和PD-L1是胃癌的雙特異性靶點，臨床前研究中，雙靶向CAR-T細胞治療對Trop2和PD-L1陽性的胃癌細胞有特異性的殺傷能力，雙特異性抗Trop2和抗PD-L1 CART細胞能夠產生更多的干擾素γ和IL-2；在人胃癌異種移植模型中，雙靶向CAR-T細胞經瘤內注射可明顯抑制腫瘤生長，其中腫瘤生長曲線的統計分析表明，抗Trop2和抗PD-L1 CAR-T組的腫瘤體積明顯小于單靶向CART對照組；因此抗Trop2和抗PD-L1雙特異性CAR-T細胞的殺傷能力和抑制作用高于單靶向CAR-T細胞［25］。CEA和MSLN是胰腺癌的雙特異性靶點，在異種移植瘤實驗中，由CEA和MSLN構成的Dual CAR-T細胞治療雙抗原陽性的胰腺癌細胞系AsPC-1腫瘤移植小鼠，Dual CAR-T細胞可顯著抑制AsPC-1腫瘤的生長，與單靶向CAR-T細胞相比，具有較高的抗腫瘤活性。Dual CART細胞可精確定位于腫瘤部位，對腫瘤細胞具有高度的殺傷作用，同時減輕了“靶上、靶外”毒性［26］。

FAP和F19是惡性胸膜間皮瘤的雙特異性靶點，FAP主要表達于腫瘤相關成纖維細胞的表面以及特定的腫瘤類型，F19是一種單克隆抗體，可在臨床試驗中識別未降解的FAP［27-28］，但是兩者聯合的抗FAP-F19-ΔCD28/CD3ζ-CAR在CD8陽性的T細胞中表達，此種T細胞可以導致IFNγ特異性的釋放，其中的雙特異性抗原重新定向的T細胞在體外裂解抗原陽性間皮瘤細胞和炎性成纖維細胞，增強抗癌活性［27］。

3 多靶向CAR-T的主要優勢

單靶向CAR-T細胞治療后復發最常見的機制是靶抗原丟失。目前，已證明抗原的丟失可以通過抗原逃逸、譜系轉換和抗原下調3種不同的機制發生。抗原逃逸機制是由惡性腫瘤通過獲得性突變、選擇性剪接靶點基因、內質網中保留突變的錯誤折疊的靶點蛋白而產生［11，29］。譜系轉換是指腫瘤細胞通過表型轉換至不同的譜系，這種轉換過的譜系不具備原有的靶向受體，因此細胞可以通過譜系轉換來完成抗原丟失的過程，最終導致抗原丟失，及腫瘤抵抗情況發生［30］。多靶向CAR-T可以避免抗原丟失的情況發生，在異種移植實驗中，取來源于復發患者的標本建立異種移植模型，其中復發模型HMB28（CD19-/CD22+）是由于原發性致癌因子的一個點KRAS G12D發生突變，導致CD19由陽性轉為陰性，但雙靶向CAR-T能阻止HMB28的進展［5］，這表明多靶向CAR-T可有效的防止由于基因突變導致的靶點轉為陰性的問題。多靶向CAR-T細胞結構的變化和提升，可促進免疫治療的發展。因此，研究證明CAR結構中胞外區構象和單鏈抗體定位對雙靶CAR的活性有顯著的影響［8］。靶向FMS樣酪氨酸激酶3（FMS-like tyrosine kinase 3，FLT3）在約30%急性髓性白血病（acute myelogenous leukemia，AML）患者中發生突變，患者預后較差，以單鏈抗體結構為靶點的最初抗FLT3-CAR結構無法區分野生型和突變型FLT3，因此需要另一個靶點。靶向FLT3的配體可能是一種更有效的消除白血病的策略，并同時降低脫靶反應［31］。因此多靶向CAR-T可能是克服單靶向CAR-T細胞治療后靶點突變或抗原下調的有效策略之一。

4 多靶向CAR-T聯合其他療法

多靶向CAR-T 可以聯合其他治療方式，增強殺瘤效果。如多靶向CAR-T聯合藥物、抗體、疫苗或者PD-L1 和程序性死亡受體-1（programmed cell death protein-1，PD-1）阻斷劑來治療癌癥。1）多靶向CAR-T 聯合藥物治療：雙靶向FLT3 和FLT3 的配體的CAR-T 同時使用FLT3 抑制劑克林苯胺（crenolanib）聯合治療可以導致FLT3 表達上調及改善CAR-T 細胞的活性，從而減少FLT3 陰性比例［32］，提示多藥物聯合治療可以作為預防抗原丟失的一種潛在策略。2）多靶向CAR-T 聯合抗體治療：其中最廣為人知的結構是雙特異性T 細胞接合器（CAR-T cells secreting BiTEs）［33］，BiTE 是一端靶向腫瘤抗原而另一端是靶向CD3ε 區域的雙特異性可溶性抗體［34］，雙特異性抗體是在一個分子中有2個不同抗原結合位點的抗體［35］。此種結構的CAR-T細胞能夠將可溶性抗體傳遞到實體腫瘤微環境中［23］，將CAR-T與抗體結合治療。3）多靶向CAR-T 聯合疫苗治療：最新的研究表明，安非他明疫苗聯合雙特異性CART，與單用雙特異性CAR-T相比，可增強殺瘤效應，導致腫瘤生長明顯減緩和生存期延長［36］，有利于提高抗原特異性表達，減少表面抗原丟失的現象發生，增強CAR-T 抗實體瘤活性，突破實體瘤治療瓶頸。4）多靶向CAR-T細胞聯合PD-L1或PD-1阻斷劑治療：將BCMA 和CD319 的雙 靶向CAR-T 聯合PD-1 阻斷劑，可進一步加速體內腫瘤的初始清除率，獲得治療的持久性［21］。因此多靶向CAR-T聯合其他方式治療惡性腫瘤可能是克服癌癥轉移復發的有效策略之一。

5 結語

綜上所述，多靶向CAR-T 在治療惡性腫瘤方面具有廣泛的適用性，能夠減少腫瘤復發的問題。并且，三價CAR-T細胞也正在研發中，可用于治療血液惡性腫瘤和多形性膠質母細胞瘤［37］。雖然多靶向CAR-T療法相對于單靶向CAR-T具有明顯的潛在優勢，但這些產品在安全性、有效性和可行性方面還有一些尚未解決的問題，如細胞介導毒性、PD-L1 與腫瘤細胞結合、T細胞分化和衰竭導致治療效果下降等問題［38-40］。隨著研究的深入，未來可優化多靶向CAR-T 的設計，擴大多靶向CAR-T 的研究，多靶向CAR-T聯合其他方式治療惡性腫瘤可能是未來的發展方向。多靶向CAR-T可能成為克服抗原逃逸最為有效的方式之一，從而降低癌癥復發的風險。