對蝦病害防控的理論與實踐

劉 梅, 王寶杰, 蔣克勇, 王 雷

(中國科學院海洋研究所實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071)

從2001年至今我國對蝦的年產量一直穩居世界首位, 2017年達到 134.5萬噸[1], 其中凡納對蝦(Penaeus vannamei)是目前我國對蝦養殖的主導品種。2018年9月, 全球第二大市場研究機構Markets and Markets發布“對水產養殖品市場全球預測”報告顯示, 2018年我國的對蝦消費為全球第一, 達到200萬噸。我國對蝦市場需求未來將保持較高增速,存在巨大的供需缺口, 市場發展前景廣闊。

雖然對蝦產量持續增長, 但是病害一直是影響我國對蝦養殖業發展的主要問題。據統計, 自1990年代初以來, 由于疾病造成的損失約為每年 10億美元[2]。層出不窮的病害導致對蝦養殖業成為既高回報又高風險的行業。筆者所在研究團隊多年來立足于我國對蝦養殖產業的實際需求, 以對蝦抗病反應機理的探究為基礎, 分析對蝦應對病原微生物、真菌毒素以及環境脅迫的反應機理。同時注重研究成果的轉化, 開發了系列化安全投入品, 并積極推動對蝦養殖模式的轉型升級。

1 對蝦機體免疫機理研究

根據目前的研究結果顯示, 對蝦養殖業危害最嚴重的病原主要為細菌和病毒。危害對蝦養殖的病毒主要包括白斑綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus, WSSV), 黃頭病毒(Yellow Head Virus, YHV)和桃拉病毒(Taura Syndrome Virus, TSV)等。其中WSSV是最危險的致病性病毒之一, 可導致對蝦90%～100%的死亡率[2]。近年來, 隨著無特定病原SPF(Specific Pathogen Free)蝦苗的推廣應用, 病毒性病害對對蝦養殖業的危害逐漸減弱, 蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)、致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticuscausing AHPND,VpAHPND)成為對蝦養殖的主要病害, 而由養殖環境富營養化導致的肝胰腺壞死癥和白便綜合征等也成為了影響對蝦產量的重要因素。針對病害種類不斷變化的對蝦養殖業現狀, 近年來研究團隊立足于對蝦自身的免疫反應機制, 探討了對蝦應對病原微生物、霉菌毒素以及環境脅迫等不同類型外界因素的反應機制, 為對蝦病害的防控積累了豐富的基礎數據。

1.1 對蝦應對病原微生物的免疫反應機理

弧菌一直被認為是很多無脊椎動物特別是蝦的主要致病菌。高密度對蝦養殖導致養殖水環境惡化,進而由弧菌引發對蝦養殖病害, 特別是近年來致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌(VpAHPND)的危害日益嚴重, 對養殖業造成巨大的經濟損失。為深入探究弧菌的感染機理, 基于 Cox比例風險模型, 探究了哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)不同菌株、劑量及感染方式對凡納對蝦的攻毒效果的影響, 從而為有效控制弧菌攻毒試驗的風險因素提供指導[3-4]。在此基礎上, 通過一系列弧菌攻毒實驗, 探討了對蝦腸道和肝胰腺對致病性副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)的響應機制。分析發現凡納對蝦感染副溶血弧菌后, 細胞凋亡相關基因和抗病相關基因如抗菌肽等的表達水平升高, 肝胰腺抗氧化酶類基因表達發生顯著變化, 而生長代謝相關信號通路受到抑制[5]。利用轉錄組測序(RNAseq)技術及生物信息學分析, 探究腸道黏膜屏障在凡納對蝦抵御副溶血弧菌感染中的作用。通過對差異表達的基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)的分析, 發現凡納對蝦腸道黏膜中對副溶血弧菌攻毒做出反應的基因涉及到腸道黏膜的免疫屏障、化學屏障和機械屏障的相關功能。組織切片和透射電鏡觀察副溶血弧菌感染后的對蝦腸道組織細胞結構變化, 可見腸道上皮組織發生細胞連接破壞、細胞核固縮、溶酶體和凋亡小體出現等明顯變化。表明腸道黏膜副溶血弧菌感染后發生了機械、化學及免疫功能的改變, 上述生理反應在凡納對蝦腸道抵御弧菌感染的過程中發揮重要作用[6-7]。

1.2 對蝦應對真菌毒素-黃曲霉毒素的反應機理

飼料和原料中黃曲霉毒素 AFB1污染導致養殖動物攝食率降低、代謝紊亂、飼料轉化效率降低以及對病害的抵抗力降低, 成為危害對蝦養殖的重要因素。肝胰腺和腸道是對蝦主要的消化、營養和代謝器官, 在其生長和免疫方面具有非常重要的作用。為了研究凡納對蝦應對 AFB1的響應機制, 近年來分別針對不同劑量黃曲霉毒素對凡納對蝦的損傷機理進行了深入的探討, 以期在此基礎上發掘相應的解決方案。

首先, 采用高劑量黃曲霉毒素 B1(15 mg/kg)飼喂對蝦8 d, 分析其腸道和肝胰腺的反應機制。通過對肝胰腺轉錄組測序數據的分析發現, 差異表達基因(DEGs)有1 024個, 其中上調的基因153個, 下調的基因 871個。涉及的生命過程主要包括基礎代謝過程、大分子代謝過程、凋亡、細胞內吞、細胞黏附和細胞連接等。黃曲霉毒素攝入導致對蝦肝胰腺出現 R細胞數量減少、上皮層與肌皮層分離、核固縮, 細胞裂解和壞死等顯微結構的改變以及抗氧化酶活性的顯著升高[8-9]。上述結果表明高劑量短時間的黃曲霉毒素刺激對肝胰腺的代謝過程造成損傷,調控生長代謝過程的信號通路被抑制, 內質網應激被抑制, 細胞凋亡通路被激活, 肝胰腺抗氧化酶系統激活用于清除過量的活性氧(ROS)。分析高劑量黃曲霉毒素對凡納對蝦腸道的損傷發現, AFB1顯著抑制了生長代謝調控通路 mTOR通路, 刺激了免疫相關的轉錄因子Dorsal和Relish以及黏蛋白樣圍食膜因子(mucin-like PM)等基因的表達。AFB1攝入也破壞了凡納對蝦腸道組織形態。顯示高劑量 AFB1不僅影響腸道黏膜的結構, 而且損傷了腸道的免疫屏障和化學屏障[7,10]。

為更好地了解對蝦對長期攝入黃曲霉毒素的反應機制, 進行了較低劑量黃曲霉毒素的攻毒實驗。發現投喂較低劑量黃曲霉毒素 AFB1(5 mg/kg)的飼料30 d后, 對蝦存活率和體重得率顯著降低, 肝胰腺和腸道的組織形態結構損傷嚴重, 消化酶活性顯著降低[11]; 而超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化物酶活性顯著高于對照組, 并呈先升高后降低的趨勢[12]。對肝胰腺和腸道進行差異表達基因分析, 發現投喂含有AFB1的飼料導致肝胰腺(12 014個)和腸道(1 387個)出現大量差異基因表達, 其中肝胰腺中差異基因主要富集到18條與免疫相關的通路和過程, 而腸道中富集到 7條[13]; 提示相比于腸道, 肝胰腺是響應AFB1刺激的主要組織。同時, 實驗組中腸道菌群的種類和數量都明顯低于對照組, 且隨著養殖時間的延長, 實驗組中 Proteobacteria、Firmicutes、Vibrio和Photobacterium的豐度不斷增加, Bacteroidetes、Flavobacterium_sp_M和Tenacibaculum的豐度不斷降低[12]。以上結果表明, 投喂含有5 mg/kg AFB1的飼料會激活凡納對蝦抗氧化和免疫系統功能、造成腸道菌群組成紊亂、降低消化酶活性、造成組織結構損傷, 從而導致對蝦生長受到抑制、死亡率升高。另外, 與高劑量黃曲霉毒素(15 mg/kg)攝入相比, 較低劑量黃曲霉毒素攝入造成對蝦機體損傷的同時,激活對蝦免疫和抗氧化系統以應對外界刺激, 表現為大量免疫相關基因表達量上調。而高劑量黃曲霉素攝入對對蝦的生長和代謝造成致命性打擊, 表現為大量與代謝相關的基因表達量下調。

1.3 對蝦應對環境脅迫的免疫反應機理

在對蝦養殖中, 水環境因子對對蝦的生長和病害發生是至關重要的影響因素。尤其在目前高密度集約化養殖中, 養殖水質的pH波動、溶解氧降低以及養殖密度過高等環境脅迫常常導致養殖品種攝食量減少、生殖力下降、生長速度減慢, 甚至引起動物死亡。近年來通過分析逐漸降低或升高 pH環境脅迫、循環重/中度低氧環境脅迫以及養殖密度脅迫下對蝦的生長生理、基因表達以及抗病能力等的變化, 對凡納對蝦應對環境脅迫的應激反應機理有了較為深入的了解, 為水環境調控技術研發提供理論依據。

1.3.1 pH

針對養殖過程中水環境 pH值的不斷變化對對蝦養殖造成的危害, 研究了凡納對蝦在逐漸降低pH(6.65～8.20)和逐漸升高 pH(8.20～9.81)的水環境中存活、生長以及生理生化反應的變化。結果發現, 逐漸升高的 pH造成對蝦更高的死亡率, 在第 28天達到39.9%, 存活的對蝦生長狀態不佳。而逐漸降低pH中對蝦累計死亡率在第 7天之后穩定于 6.67%至第28天, 此過程中增長率和增重率先下降后恢復正常。此結果表明蝦能夠適應逐漸降低的pH環境。通過滲透調節基因表達、消化酶活性變化等分析對蝦應對pH變化的內在機理發現, 逐漸降低pH條件下, 蝦的滲透調節基因轉錄不斷增強, 消化酶活性先下降后恢復正常或不斷增加, 而對副溶血弧菌浸浴的死亡率不斷減少。由此可見蝦能夠耐受逐漸降低pH環境的主要內在機制可能主要是其高滲透調節能力, 同時通過增強消化酶活性滿足能量消耗[14-15]。對比分析不同pH條件下對蝦肝胰腺和中腸的抗氧化反應、氧化應激、氧化損傷。結果顯示, 在養殖環境pH改變的前期(≤7天), 蝦肝胰腺和中腸的抗氧化酶基因GPx、MnSOD和應激蛋白基因Hsp70表達增強, 推測為對蝦的早期適應機制, 用于清除環境脅迫產生的過量活性氧。同時, 肝胰腺相對于中腸而言, 對pH變化及其氧化應激更敏感, 這可能與其較早的產生活性氧、抗氧化反應和氧化損傷有關。而在pH改變較長時間(≥14天)后, 逐漸升高pH條件下對蝦由于氧化損傷過重導致肝胰腺和中腸喪失了抗氧化調節能力連續死亡。在逐漸降低pH環境下養殖較長時間(≥14天)后, 對蝦肝胰腺和中腸的抗氧化酶基因GST、GPx和應激蛋白基因Hsp70的轉錄增強, 該反應可能是蝦為防止ROS進一步干擾而產生抗氧化適應機制, 以此減弱氧化損傷, 達到新的免疫穩態。通過上述結果推斷, 為減輕逐漸升高pH條件對蝦的損傷, 可以重點保護肝胰腺, 從而控制蝦的死亡和生長抑制[14, 16]。

1.3.2 溶解氧

溶解氧脅迫是對蝦養殖中經常產生的環境脅迫,為探討對蝦應對溶解氧脅迫的反應機制, 模擬了循環重/中度低氧(0.8～3.5 mg/L)脅迫的水環境, 分析了對蝦在低氧脅迫下的存活、生長、生理生化反應以及抗病能力的變化。結果顯示循環重/中度低氧脅迫造成蝦的累積死亡率不斷增加, 增重率和增長率不斷下降。分析其內在反應機制, 發現消化酶活性不斷下降, 滲透調節基因轉錄先增加后恢復正常或下降,副溶血弧菌浸浴的死亡率不斷增加。由此推斷循環重/中度低氧可通過破壞滲透調節機制, 使機體失去了平衡穩態, 降低消化酶活性影響對蝦的生存和生長性能, 同時增加弧菌病害暴發的風險[14,17]。對比分析中腸和肝胰腺的抗氧化反應和氧化損傷相關基因、低氧誘導因子1a(HIF-1a)的表達發現, 短期循環重/中度低氧條件下, 蝦增強中腸和肝胰腺抗氧化酶基因、應激蛋白基因和HIF-1a基因的轉錄作為早期的適應機制, 以耐受低氧并清除過量的活性氧。同時,因為較早的氧化損傷和HIF-1a轉錄, 所以肝胰腺比中腸對低氧及其氧化應激更敏感。循環重/中度低氧脅迫持續較長時間后, 氧化損傷逐漸加重導致蝦中腸和肝胰腺喪失了抗氧化調節能力, 最終導致蝦連續死亡。在此過程中, 肝胰腺比中腸更早喪失了抗氧化調節能力。由此提示可以通過保護肝胰腺提高對蝦對循環重/中度低氧脅迫的適應能力[14,18]。

1.3.3 養殖密度

對蝦養殖中, 養殖密度的升高在提高產量的同時, 易引發病害發生和對蝦生長速度的下降。為了系統地探究對蝦應對不同密度養殖和病菌易感性的潛在機制, 分析了高密度組(800尾蝦/m3)和低密度組(400尾蝦/m3)條件下, 對蝦生長和對抗副溶血弧菌感染的能力以及內在機制的變化。結果發現高密度養殖會導致對蝦體重得率和對副溶血弧菌的抗病性顯著降低; 進一步分析發現高密度養殖條件下對蝦肝胰腺和腸道組織形態結構出現明顯損傷, 攻毒后兩組組織結構皆出現損傷, 但高密度組損傷更為嚴重[19]; 高密度養殖導致對蝦機體抗氧化物酶活性顯著升高, 呈先升高后降低的趨勢[20]; 通過轉錄組測序數據分析, 發現高密度養殖組中肝胰腺和腸道中分別有 45和 5 470個差異基因, 其中肝胰腺中差異基因富集到 4條免疫相關的通路和過程, 而腸道中富集到 14條[19]; 同時, 高密度養殖組中腸道的菌群種類和數量都顯著低于低密度組, 且隨著養殖時間的延長, 高密度組中 Bacteroidetes、Firmicutes、Pseudoalteromona和Blastopirellula的豐度不斷降低,Planctomycetes、Photobacterium和Vibrio的豐度不斷升高[22]。以上結果表明, 高密度養殖會破壞凡納對蝦肝胰腺和腸道組織形態結構、損傷免疫和抗氧化系統、造成腸道菌群組成紊亂、降低體重得率, 進而導致其抵御副溶血弧菌侵染的能力下降, 最后由于疾病感染造成更高的死亡率。另外, 相比于肝胰腺,腸道對密度脅迫更為敏感。

2 對蝦病害防控技術

國內養殖業抗生素和化學藥品濫用已經造成嚴重的水產品安全和環境安全問題, 無抗高效養殖成為未來的發展方向。我國規模養殖的環境條件、密度條件、防疫條件與歐洲國家相比尚有較大距離, 要實現無抗養殖必須要有新技術的支持和相應的替代品。近年來, 研究團隊在探討對蝦免疫反應機理的同時, 也在積極尋求安全高效的對蝦病害防控新技術和新產品。

2.1 益生菌

近年來, 微生物組學研究得力于高通量測序技術的普及已取得巨大進展, 并且在醫藥、畜牧養殖等領域已經產生了顯著的經濟效益, 被列為“能重塑未來的十大新興技術”之一。目前, 微生物制劑已經普遍用于水產養殖的病害防控和水質調控, 但是對水產動物腸道微生物的認識和益生菌的作用機理尚缺乏最基礎的認知。從解析對蝦腸道微生物組成入手,結合水生動物來源益生菌的分離篩選和作用機理的分析, 進行了一系列從理論到應用的研究開發工作。在高通量測序技術尚未普及之前, 采用 PCRDGGE法和16S rDNA文庫法研究分析了中國對蝦(P.chinensis)和日本對蝦(Penaeus japonicus)腸道微生物組成。比較分析了芽抱桿菌等對日本對蝦腸道微生物的影響, 為養殖對蝦腸道微生物區系的調控技術提供理論依據。結果表明, 中國對蝦腸道微生物屬于變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門三大類群, 其中變形細菌為優勢菌群[21]。采用同樣的方法分析了日本對蝦腸道微生物區系組成并探討了外源芽孢桿菌攝入對腸道微生物組成的影響, 發現日本對蝦攝入外源芽抱桿菌后, 腸道微生物中腸桿菌數量明顯增多,弧菌數量相對減少[22]。

隨后, 我們從水生動物腸道中分離篩選得到2株具有較好的抑菌性和黏附性的乳酸菌, 經鑒定分別命名為戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)HC-2和糞腸球菌(Enterococcus faecium)NRW-2。并深入探討了這兩株菌對凡納對蝦的益生作用及其益生機理。發現 HC-2或 NRW-2可顯著提高對蝦特定生長率; 而HC-2發酵上清液對特定生長率的影響不顯著。實時定量PCR研究發現, HC-2及其發酵上清液對肝胰腺中免疫相關基因的表達具有較高的誘導作用, 而NRW-2可顯著提高對蝦中腸中免疫相關基因的表達。此外兩株菌均可提高對蝦對病原菌的抵抗力[23-24]。飼料中添加益生菌及其發酵上清液可不同程度提高凡納對蝦腸道和肝胰腺的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等活性, 但在不同組織中提高消化酶活性的種類是不同的[23,25]。利用高通量測序技術分析凡納對蝦腸道中的細菌菌群多樣性, 數據顯示 Verrucomicrobia,Proteobacteria和Actinobacteria是對蝦腸道的優勢菌群, 飼料中添加 HC-2發酵上清液可顯著提高了對蝦腸道中 Actinobacteria的豐度, 但是對腸道的形態結構沒有明顯的改善作用, 由此推測益生菌的代謝產物可能通過調節對蝦腸道中微生物群落結構, 進而通過微生物群落之間復雜的相互作用實現對蝦健康方面的保持或促進作用[23,26]。

為進一步探討益生菌的作用機理, 對益生菌HC-2和副溶血弧菌E1(VPE1)進行熒光標記后, 觀察了其在對蝦腸道中的分布情況。發現在對蝦腸道內HC-2對VPE1具有一定的競爭排斥作用。分析HC-2與VPE1的體外共培養發現, HC-2可抑制VPE1的生長, HC-2中LuxS基因可能參與到HC-2對VPE1的競爭排斥過程。另一方面, 熱失活的HC-2菌體可以顯著促進VPE1中的毒力相關基因的表達[23,27]。

鑒于HC-2在對蝦腸道表現較好的定植性能, 進一步研究了益生菌表面蛋白在益生作用中的機制。分別用正常乳酸菌 HC-2和 LiCl除去表面蛋白的HC-2連續投喂對蝦四周, 然后用致病菌副溶血弧菌弧菌VPE1進行攻毒。電鏡觀察和免疫組化研究結果顯示正常 HC-2對腸道和肝胰腺起到良好的保護作用, 但是除去表面蛋白的HC-2沒能改善對蝦腸道表面環境; 對蝦腸道和肝胰腺中免疫相關基因表達水平、免疫和消化相關酶活性水平在投喂去除表面蛋白的乳酸菌后受到顯著影響; 去除表面蛋白顯著影響了乳酸菌在對蝦腸道的定植, 降低了對蝦在攻毒實驗中的存活率; Illumina測序分析結果顯示投喂正常HC-2組的致病菌顯著下降, 而有益菌數量顯著增加, 但是在投喂LiCl處理的HC-2組中沒有發現這一重要現象[28-29]。該結果表明HC-2的表面蛋白在其黏附定植、改善對蝦腸道絨毛層結構、保護對蝦肝胰腺、競爭性排除病原菌、增強腸道免疫反應抵抗疾病等益生功能調節方面發揮著重要的作用。利用GO/KEGG富集分析對蝦腸道轉錄組顯著差異表達基因發現, 跟免疫、細胞信號轉導、離子穩態、細胞黏附、壓力/刺激應激、血管內皮生長因子和圍食膜因子等相關基因在添加正常 HC-2對蝦腸道中呈顯著上調表達, 這些重要基因的上調表達將提高對蝦腸道的免疫應答、營養代謝、上皮細胞生長、菌體黏附定植等功能, 從而提高對蝦抵御病原菌感染和抗病能力[30]。但是添加沒有表面蛋白的HC-2不能誘導對蝦腸道中這些基因的上調表達。該結果在基因水平證明表面蛋白是乳酸菌 HC-2在蝦中腸中發揮益生菌作用關鍵因子。利用GO和KEGG富集分析對蝦腸道顯著差異表達蛋白發現, 參與免疫系統過程、代謝過程、黏附過程和細胞-細胞信號過程相關的蛋白在添加正常 HC-2對蝦腸道中呈顯著上調表達, 而在添加經LiCl除去表面蛋白的HC-2投喂對蝦腸道中呈顯著下調表達[31]。該研究結果在蛋白水平證明了表面蛋白在介導 HC-2調節對蝦腸道免疫應答、營養代謝、細菌黏附和信號傳遞過程中發揮了重要作用。

在深入探討乳酸菌益生機理的同時, 致力于研發乳酸菌在水產養殖中的高效應用技術。考慮到乳酸菌制劑菌量衰減快、保存期較短等特性, 為最大限度地獲得高含量的活菌與代謝產物, 開發了乳酸菌現場小型生物工程發酵罐裝置, 該裝置可以自動加溫消毒及恒溫控制等, 控制精準, 穩定性好, 安全耐用, 并強化了保溫性能, 節約能源, 可簡便、精確、快速地進行現場發酵。復合乳酸菌經現場培養后, 菌體均處于增殖高峰期, 菌數含量高(可達2.0×109CFU/mL)、菌體活力強, 投放后可最大程度的發揮作用。基于對蝦養殖生產的實踐, 建立了乳酸菌的現場生產和使用規程。應用后發現其促進攝食、加速生長及降低發病率等功效突出, 根據追蹤觀察以及養殖戶反映, 乳酸菌拌料后對蝦攝食迅速, 而且不隨環境的變化而上下波動, 腸道更加清晰且粗壯,在后期腸炎高發時, 乳酸菌拌料的池塘幾乎沒有發生腸炎。

2.2 功能蛋白

重組抗菌肽是一類利用基因工程技術生產的小分子多肽, 其特點是分子量小、熱穩定好、具有廣譜抗菌活性, 在解決病原微生物對抗生素不斷增強的抗性方面, 被公認為具有極大應用潛力。從承擔十一五863項目“抗病功能蛋白漁藥研制”開始, 進行了一系列抗病功能蛋白的基因克隆和重組表達的研究工作。先后從中國對蝦中克隆了一個血藍蛋白基因FcHC, 通過與已有抗菌肽序列的分析比對發現中國明對蝦血藍蛋白的 C末端存在有抗菌肽的可能性。為進一步確認其 C末端(FcHC-C)的抗菌功能, 將血藍蛋白2個C末端基因片段連接到畢赤酵母表達載體pPIC9K中, 實現了血藍蛋白2個C末端抗菌肽的重組表達。體外抑菌實驗顯示, 重組多肽 rFcHC-C1和 rFcHC-C2作為陰離子抗菌肽具有抗真菌和抗細菌的活性[32-34]。

同時, 對重組表達的其它抗菌肽進行了發酵工藝和給藥途徑的研究。對大腸桿菌表達的抗脂多糖因子進行了發酵培養基與培養條件的優化, 獲得了抗脂多糖因子原核重組表達的最佳培養基組成和最佳培養條件, 優化后的目的蛋白產量是優化前的2.16倍。參考搖瓶培養條件, 對原核表達的抗脂多糖因子在發酵罐中進行了高密度發酵, 得到目的蛋白占總可溶性蛋白的10.5%[35-36]。

重組蛋白類藥物與抗生素相比存在穩定相差、半衰期短、易被消化酶降解等問題, 極大的影響了其口服給藥的有效性。在實際應用中, 通過微膠囊化技術對重組多肽進行控/緩釋作用是一種有效的解決途徑。嘗試以海藻酸鈉為壁材對重組表達的對蝦素進行了微膠囊化處理, 采用凝聚法制備了重組抗菌肽-海藻酸鈉微囊, 得到包封率 83.87%的微囊。微囊在模擬胃液中釋放率較低, 2 h釋放量低于14%, 而在模擬腸液中持續釋放, 5 h時釋放量達98%, 可見海藻酸鈉微囊可保護重組抗菌肽抵抗胃液的破壞, 同時具有良好的腸溶性。上述結果為解決重組抗菌肽在水產養殖中的口服給藥問題, 促進其在水產病害防治過程的應用提供了數據和理論支持[37-38]。動物養殖實驗表明, 飼料中添加5～20 mg/kg重組對蝦素可顯著降低嗜水氣單胞菌對羅非魚造成的死亡率,低劑量重組抗菌肽(5～10 mg/kg)可顯著提高羅非魚的增重率。通過分析羅非魚的生理生化反應發現重組對蝦素提高了羅非魚的紅細胞總數以及過氧化氫酶的活性; 但是高劑量對蝦素(50 mg/kg)對羅非魚造成明顯的毒副作用[35,39]。

2.3 生物發酵飼料

生物飼料被國際上公認為是極具潛力的“第四代飼料”, 近年來得到國內外關注。所謂生物飼料是指利用基因工程、蛋白質工程、發酵工程等高新技術所開發的新型飼料資源, 如酶制劑、益生菌、生物活性肽和寡糖等。它可以提高飼料效價和利用率, 有效節約資源, 大幅度減少環境和水體污染, 有效增強動物的免疫抗病力, 預防病害, 保證安全, 杜絕有害物和違禁品使用等。

通過生物酶解動物蛋白制備小肽, 使其具有更高的吸收利用率; 利用復合益生菌發酵植物蛋白包括生粕、豆粕和麩皮等, 發酵的植物蛋白含有更高的益生菌含量、高蛋白、高消化率并且原料低廉易得;將飼料酵母經過特殊工藝誘導自溶及超微破壁, 釋放胞內及胞壁活性物質且得以全部保留, 破壁率高達 91.6%。將上述新型原料經過合理平衡和有機集成, 開發出新型的對蝦生物飼料, 與普通飼料相比,具有低蛋白、高消化率、富含益生活菌及有機酸等特點。采用上述工藝制備的生物飼料進行了 8周的生產性養殖試驗, 結果表明生物飼料可顯著提高對蝦的生長性能和存活率, 降低飼料系數。分析攝食生物飼料的對蝦的各項生化指標發現, 對蝦的 SOD、血清總蛋白含量、溶菌活性及對蝦總蛋白酶活性較普通飼料組有顯著提高, 但是抑菌活性未發現顯著差異。生物飼料組水體中的 NH4-N、NO2-N等水質指標略低于普通飼料組, 但兩者無顯著差異[40]。

同時, 我國凡納濱對蝦養殖規模不斷擴大, 作為對蝦配合飼料主要蛋白源的魚粉產量逐年下降,價格逐年攀升, 尋找魚粉的替代物已經成為凡納濱對蝦養殖業面臨的現實問題, 也是對蝦飼料和營養學研究領域的重點和難點問題。近年來評估了幾種魚粉替代源在對蝦養殖中的可行性并分析了其影響對蝦生長的內在機制。首先, 進行了生物絮團替代魚粉的生產應用評估。結果發現以生物絮團替代 15%的魚粉并未對對蝦的生長產生影響, 而且在消化酶活性以及生長代謝相關基因的表達調控方面并無顯著差異, 說明以生物絮團替代 15%的魚粉在生產上是可行的[41-42]。其次, 探討了青貯魚粉替代魚粉的可行性及合理替代水平。結果表明以青貯魚粉替代25%的魚粉, 對凡納對蝦的生長和生長代謝調控網絡未造成顯著影響。高水平替代(50%～100%)會顯著降低對蝦生長, 分析其內在機理發現對蝦體內mTOR信號通路和腸道微生物菌群發生了顯著改變,表明如果以青貯魚粉替代凡納濱對蝦飼料中的魚粉,替代量少于 25%是較為可行的[41,43]。再次, 探討了發酵豆粕替代凡納濱對蝦配合飼料中魚粉的可行性。結果顯示以發酵豆粕替代凡納濱對蝦飼料中20%的魚粉可顯著促進對蝦的生長、消化和生長代謝調控通路。并發現mTOR信號通路中關鍵基因的表達與生長表現之間呈現高度一致性, 但是發酵豆粕替代對腸道微生物菌群未產生顯著的影響。由此可見發酵豆粕替代對蝦配合飼料中 20%魚粉是合理的替代方案, 并可通過影響 mTOR信號通路相關基因的表達達到促生長的效果[41,44-45]。

3 研究展望

3.1 組學時代的對蝦病害防控

深入解析養殖物種生產性狀的內在遺傳物質基礎對于提高養殖效率具有至關重要的作用。近年來,隨著組學技術(轉錄組學、基因組學、微生物組學、蛋白質組學和代謝組學)的飛速發展和推廣應用, 使我們對水產動物的生命過程有了越來越深入的了解。其中隨著對蝦基因組序列的破譯, 讓我們對對蝦的遺傳物質基礎有了全面的認知。與此同時, 頻發的病害和防治技術的缺乏導致對蝦養殖業產生巨大損失, 世界范圍內很多研究團隊投入大量精力發掘有應用潛力的對蝦基因資源。然而, 基因資源的發掘離實際應用尚有很長的距離。對蝦病害防控技術的發展將進一步依托組學技術提供的龐大信息資源, 通過對數據的積累與分析, 著眼于對蝦自身的生命過程解析及體內外共生微生物的功能分析, 深入探討影響對蝦養殖的“環境組-微生物組-表型組”三者相互作用關系, 為對蝦養殖的環境因子調整、安全投入品研發等提供理論和技術支撐。

3.2 對蝦養殖模式升級與病害防控

近年來, 隨著現代信息技術和物聯網、云計算等技術的快速發展, 大數據和物聯網被越來越多地應用于現代農業, 但是其發展速度和技術水平明顯落后于其他產業中的應用。水產業作為現代農業的重要組成部分, 其智能化和信息化程度尤為薄弱, 主要表現在： 集約化程度低、各自經營為主、信息無法共享; 環境、病原等檢測能力弱, 更缺乏分析處理能力; 缺乏技術服務支撐、缺乏分析總結、缺乏科學模式等, 造成病害防控困難, 環境污染難以控制等嚴重問題, 這些問題在對蝦養殖中表現的更加突出。隨著互聯網和信息化技術的飛速發展, 基于水產大數據的智慧化養殖是實現水產規模化標準化的必然之路。物聯網技術在國內水產養殖業中的大規模生產應用較為少見, 多數停留在學術研究方面。中國農業大學信息與電氣工程學院李道亮教授團隊圍繞我國水產集約養殖數字化發展和全程自動監控及科學管理的重大需求開展研究工作, 積極開展了養殖水質傳感器、水產養殖優化調控模型、水產養殖智能裝備研究。提出了水產養殖實時數據在線處理模型與方法, 構建了基于實時數據與知識庫聯合驅動的魚類生長動態優化調控模型。水產集約化養殖測控技術依靠精準的、自動化的、機械的、變量的一種生產方式, 增氧更合理, 投餌更合理, 使養殖密度增加[46]。但是針對對蝦養殖的智能化管控技術尚無實際運行的案例。今后的工作通過水質環境監測、對蝦攝食行為分析、管理數據收集、大數據分析、智能投飼系統等各關鍵要素的系統分析和數據應用, 建立對蝦養殖智能化管控平臺, 通過整合物聯網技術,實現數據科學分析, 設施裝備智能化、自動化管控,產業整體要素重組和全面提升, 實現對蝦健康生態養殖。