胰高血糖素樣多肽-1對肺臟炎癥的抑制作用研究進展

白 玉， 趙立紅， 連朋敬， 李靜云， 喬 健

(中國農業大學動物醫學院， 北京海淀100193)

胰高血糖素樣多肽-1(GLP-1)是由胰高血糖素(GCG)基因編碼的一種分泌型多肽，具有誘導胰島素分泌、降血糖、抑制內質網應激、抵抗氧化應激等多種生物學功能。由于GLP-1在體內半衰期極短，易被降解，因此科學家開發出具有較長半衰期的GLP-1多肽分子相似物——胰高血糖素樣多肽-1受體激動劑(GLP-1Ra)，并將其作為治療2型糖尿病(T2DM)的藥物，現已上市。GLP-1和GLP-1Ra除用作治療T2DM外，還具有抑制多種組織器官炎癥的作用。本文就GLP-1和GLP-1Ra抑制肺臟炎癥作用及其機制的研究進展進行綜述，為進一步探討GLP-1或GLP-1Ra作為抗肺炎藥物的研發提供參考依據。

1 胰高血糖素樣多肽-1的生物合成及其釋放

胰高血糖素樣多肽-1(Glucagon like peptide-1，GLP-1)是由胰高血糖素(Glucagon，GCG)基因編碼的一種分泌型多肽，早在20世紀80年代科學家已經克隆出GCG基因，并發現其編碼多種多肽分子。GCG基因含6個外顯子(E1～E6)，它們分別編碼腸高血糖素相關胰腺多肽(Glicentin-related pancreatic polypeptide，GRPP)、胰高血糖素(GCG)、GLP-1、胰高血糖素樣多肽-2(Glucagon like peptide-2，GLP-2)以及信號肽等不同種類的多肽分子[1]。GCG基因被翻譯成多種不同多肽分子的過程為：首先GCG基因在細胞核內轉錄GCGmRNA，后者通過核孔進入細胞質中，在核糖體上以GCGmRNA為模板翻譯出長度為180個氨基酸的胰高血糖素原(Proglucagon)[2]，胰高血糖素原在不同器官或細胞中被激素原轉化酶(Prohormone convertase，PC)切割成不同的多肽分子后，再分泌到細胞外，其中，在胰腺內胰高血糖素原被激素原轉化酶2(PC 2)切割成GRPP和GCG再分泌到胞外，在中樞神經系統和腸道中胰高血糖素原被激素原轉化酶1/3(PC 1/3)切割成胃泌酸調節素(Oxyntomodulin)、GLP-1和GLP-2，在胞質中GLP-1的C端或N端進一步分別被切割掉6個或1個氨基酸后形成有活性的GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)形式再被分泌到胞外，有活性的GLP-1與胰高血糖素樣多肽-1受體(Glucagon like peptide-1 receptor，GLP-1R)結合激活下游細胞信號通路，從而行使生物學功能[3]。

2 胰高血糖素樣多肽-1的結構組成及其主要生物學功能

GLP-1是由37個氨基酸組成的多肽分子(中插彩版圖1A)，GLP-1的第1～6位或第37位氨基酸被酶切掉修飾生成2種活性形式，即GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)，其中前者是體內存在的主要形式。當活性形式的GLP-1與受體結合并激活下游通路后，其第1～2位氨基酸(GLP-1全長的第7～8位氨基酸)被酶切掉修飾成無活性的GLP-1，即GLP-1(9-36)和GLP-1(9-37)。由于GLP-1(7-36)僅由30個多氨基酸組成，其天然構象雖然僅為連續的α-螺旋結構(中插彩版圖1B)，但具有多種生物學功能，是生命過程中不可缺少的一種激素。

胰高血糖素多肽-1受體(GLP-1R)是一種七跨膜α-螺旋結構的B類G蛋白偶聯受體(B-GPCR)[4]，其氨基酸序列的N端位于細胞膜外側，有6個半胱氨酸位于N末端，其與配體的結合有密切關系，N端氨基酸序列被糖基化修飾后使GLP-1R結構穩定；其氨基酸序列的C端位于細胞膜內側，與α、β和γ亞基三聚體結構的G蛋白組成GLP-1R-Gs復合體[2]。靜息狀態時，GLP-1R-Gs復合體中的G蛋白與GDP結合，當活性形式GLP-1與GLP-1R的N端結合后，GLP-1R被激活，在Mg2+參與下，誘導與G蛋白結合的GDP與胞質中GTP交換形成GTP-αβγ結構，然后GTP-α與βγ分離，游離的GTP-α激活胞膜上的腺苷酸環化酶(Adenylate cyclase，AC)，AC催化腺苷酸環化生成第二信使cAMP并變構激活蛋白激酶(Protein kinase，PK)A，活化后的PKA激活絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)、CHOP等功能蛋白發揮相應生物學功能[5]；與此同時，GLP-1被酶切割成無活性形式并與GLP-1R分離，而α亞單位本身具有GTP水解酶活性，促使GTP-α釋放Pi形成GDP-α，后者再與βγ亞單位形成GDP-αβγ形式而恢復到靜息狀態[2]。

GLP-1(7-36)與GLP-1R互作后通過cAMP信號通路激活PKA和Gadd34蛋白以減弱內質網應激反應。有研究表明，GLP-1(7-36)通過高表達Bcl-2蛋白降低機體在病理情況下細胞凋亡數量[6]。有資料顯示，GLP-1(7-36)能有效提高血管內皮細胞活性和減少活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產生，在機體內還能修復受損的血管內皮結構保證血管的完整性[7]。核因子(Nuclear factor，NF)-κB能調控細胞因子和趨化因子等多種蛋白質的表達，GLP-1(7-36)與GLP-1R互作后通過激活PI3K/Akt信號通路抑制NF-κB的磷酸化，細胞內低表達磷酸化NF-κB會降低促炎因子的表達，最終抑制炎癥反應。Epac2蛋白是調控胰島素分泌的關鍵蛋白，在胰島β細胞中GLP-1(7-36)通過調節Epac2蛋白活性促進胰島素分泌。

3 GLP-1和GLP-1Ra與肺臟炎癥

近些年科學家相繼發現，GLP-1(7-36)能夠抑制多種組織器官的炎癥，尤其對呼吸系統炎癥的抑制作用更加明顯，故GLP-1有望被開發成為一種抑制肺臟炎癥的靶向藥物[8]。因GLP-1(7-36)在體內能被血管內皮上的二肽酰肽酶-Ⅳ(Dipeptidylpeptidase-Ⅳ，DPP-Ⅳ)很快降解并失去其生物學功能，導致GLP-1在體內的半衰期不超過2 min；因此，科學家運用現代分子生物學手段制備出與GLP-1(7-36)具有高度同源性且生物學功能相近的GLP-1Ra，其中同源性最高且在科學研究和臨床中最常用的是利拉魯肽，其34位點由賴氨酸取代精氨酸，并通過谷氨酸間隔子在第26位賴氨酸上增加了1個16-碳棕櫚酰脂肪酸側鏈，這些改變不僅降低其被DPP-Ⅳ的降解作用，還增強了與受體的親和力[1]。GLP-1Ra同樣可與GLP-1R結合激活相同的下游通路，且GLP-1Ra的體內半衰期明顯延長，可長達13 h。有研究發現,小鼠肺臟中GLP-1R表達量顯著高于腦、腸道和腎臟等器官[9]，結果提示,GLP-1R可能是治療肺炎等肺臟疾病的重要靶點之一。

3.1 GLP-1和GLP-1Ra與非感染性肺炎 運用低劑量卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)長期持續刺激小鼠呼吸道能夠誘導小鼠發生非感染性肺炎，有學者對OVA誘導的肺炎病理模型小鼠多次注射利拉魯肽后，經病理組織學檢查發現，注射利拉魯肽小鼠肺炎發病程度、呼吸道內黏液分泌量明顯減少，以及肺泡灌洗液中細胞數量和蛋白質濃度均低于未注射利拉魯肽小鼠，上述結果表明，利拉魯肽可有效減輕肺炎發病程度并制止肺泡的炎性滲出。OVA主要通過高表達磷酸化NF-κB誘導肺炎的發生，Western Blot檢測發現給OVA誘導的肺炎小鼠注射利拉魯肽后，其肺臟中磷酸化NF-κB表達量較未注射小鼠明顯降低；運用H-89(PKA抑制劑)處理OVA誘導的肺炎小鼠模型后，利拉魯肽抑制肺臟炎癥的作用減弱，磷酸化NF-κB表達量較未用H-89組明顯增加，該結果進一步證明，利拉魯肽是通過PKA/NF-κB途徑抑制OVA誘導的非炎癥性肺炎[5]。運用適宜濃度的OVA加LPS多次吸入式刺激雌性小鼠可誘導雌性小鼠發生慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)，再對該病理模型小鼠多次注射利拉魯肽，結果發現，在刺激后第21天時注射利拉魯肽小鼠未見小鼠死亡，而未注射利拉魯肽小鼠死亡率高于50%，表明利拉魯肽能有效降低因COPD引起的小鼠死亡風險[9]。靜態肺功能指數是衡量肺臟功能的重要指標之一，靜態肺功能指數越小，表明肺臟功能越好，對COPD模型小鼠注射利拉魯肽后，測定小鼠靜態肺功能指數發現，注射利拉魯肽小鼠靜態肺功能指數明顯小于未注射小鼠，此結果說明利拉魯肽能提高小鼠靜態肺功能，病理組織學檢查發現,注射利拉魯肽小鼠肺臟炎癥的發病程度明顯低于未注射利拉魯肽小鼠，主要表現為注射利拉魯肽小鼠的肺泡中炎性細胞數量和蛋白滲出量明顯少于未注射小鼠[9]。動物患肺炎時，其肺泡灌洗液和肺臟中細胞因子和趨化因子分泌量明顯增多，給肺炎小鼠多次注射GP-1Ra后，IL-1β、IL-6和TNF-α分泌量明顯減少，說明GLP-1Ra可有效抑制肺炎發生時細胞因子的生物合成[10]。巨噬細胞在肺臟炎癥的發病過程中扮演重要角色，巨噬細胞被刺激后能夠分化成為Ⅰ型和Ⅱ型巨噬細胞，其中Ⅰ型巨噬細胞分泌促炎因子，如IL-1β和TNF-α等；而Ⅱ型巨噬細胞分泌抑炎因子，如IL-10等，肺炎時肺臟固有巨噬細胞和肺泡巨噬細胞均表現為Ⅰ型表型并分泌大量促炎因子，加重肺炎發病程度以及伴有嚴重的急性肺損傷。有研究發現，GLP-1能誘導人巨噬細胞表型轉化，即從Ⅰ型表型轉化為Ⅱ型表型以及分泌抑炎因子—IL-10 等，并且在0.5～30 nmol/L濃度范圍內，GLP-1對巨噬細胞表型轉化呈現劑量依賴性特點，但抑制STAT3磷酸化后，GLP-1誘導巨噬細胞表型轉化的生物學功能將減退或消失，此結果說明GLP-1通過p-STAT3通路將Ⅰ型巨噬細胞轉化為Ⅱ型巨噬細胞[11]，由此推斷GLP-1可能通過將Ⅰ型巨噬細胞轉化為Ⅱ型巨噬細胞從而發揮抑制肺臟炎癥的作用。肺部血管內皮細胞的氧化損傷往往可誘導急性肺損傷的發生，而急性肺損傷多伴有嚴重肺臟炎癥的發生，GLP-1Ra能減弱血管內皮細胞氧化應激損傷以及保持血管內皮細胞活力，最終使肺臟炎癥也隨之減輕[3]。

3.2 GLP-1和GLP-1Ra與感染性肺炎 呼吸合胞體病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)能誘導小鼠肺部發生Ⅱ型變態反應以及IL-13和IL-33等細胞因子大量分泌，有研究者運用9×105PFU數量的RSV感染BALB/c小鼠后，能夠誘導小鼠發生明顯的Ⅱ型變態反應，再對感染小鼠持續多天注射利拉魯肽后發現，其肺泡灌洗液中不但細胞總數、CD4+T淋巴細胞、IL-13+ILC2細胞及IL-33+嗜堿性粒細胞數量比未注射利拉魯肽小鼠明顯減少，而且IL-13和IL-33分泌量也明顯降低，糖原染色試驗發現，注射利拉魯肽小鼠的呼吸道中黏液分泌量也明顯降低，但病毒載量和IFN分泌量未見明顯變化，此結果提示利拉魯肽能減輕RSV誘導的小鼠肺臟Ⅱ型變態反應[12]，此研究首次報告GLP-1Ra能抑制病毒引起的肺臟炎癥，但其抑制炎癥的分子機制迄今沒有闡述。鏈格孢菌感染小鼠后能引起小鼠肺臟中IL-33、IL-5、IL-13、CCL11、CCL17等細胞因子和趨化因子大量釋放以及肺泡灌洗液中ILC2細胞、嗜酸性粒細胞以及CD45-EpCAM+肺上皮細胞數量增多，對鏈格孢菌感染小鼠連續多次注射利拉魯肽后發現，小鼠肺泡灌洗液中CD45-EpCAM+肺上皮細胞、ILC2細胞總數、IL-5+ILC2細胞數以及IL-13+ILC2細胞數比未注射利拉魯肽小鼠均明顯減少(P<0.05)，與此同時，IL-13、IL-5、IL-9以及CCL-22等細胞因子和趨化因子均明顯減少(P<0.05)，上述試驗結果均表明，利拉魯肽能有效減輕鏈格孢菌引起的肺臟炎癥反應[8,13]。當病原微生物侵入肺臟后，模式識別受體識別病原微生物并激活NF-κB信號通路而誘導天然免疫反應，引起大量細胞因子和趨化因子的釋放，對肺炎小鼠注射GLP-1Ra后，GLP-1Ra能夠與細胞膜表面的GLP-1R結合并通過PI3K/Akt信號通路抑制NF-κB的磷酸化以減少細胞因子和趨化因子的產生，從而緩解或抑制肺炎發生[6,14]。內質網應激是由于內質網中鈣離子紊亂和蛋白質不能正確折疊，導致細胞內質網腔內環境穩態失衡，從而使其生理功能紊亂的過程。病毒侵入宿主后能夠誘導宿主細胞發生內質網應激以抵抗病毒的復制，與此同時，內質網應激能引起宿主發生強烈的炎癥反應，而GLP-1或GLP-1Ra可通過PKA/Gadd34通路降低內質網應激的反應強度并抑制eIF2α的磷酸化，從而減少促炎因子基因的轉錄和翻譯，最終降低或抑制宿主的炎癥反應[15]。細菌、病毒或支原體等生物性因素感染宿主肺臟后因其能夠破壞細胞結構，引起宿主肺臟細胞氧化—抗氧化平衡被打破而產生大量ROS，其結果是誘導宿主發生不同程度的肺損傷和炎癥反應，而GLP-1和GLP-1Ra能顯著降低細胞氧化應激水平以減弱由病毒、細菌或支原體引起的肺損傷或肺炎等[6]。

4 小結與展望

GLP-1或GLP-1Ra與GLP-1R結合后通過激活下游PI3K/Akt信號通路抑制NF-κB磷酸化，進而使多種細胞因子和趨化因子表達降低以減輕肺臟炎癥反應。GLP-1或GLP-1Ra還能通過降低肺臟內質網應激和恢復氧化—抗氧化系統平衡抑制肺臟炎癥反應。GLP-1Ra如利拉魯肽、安塞多肽等通過化學修飾后，其分子結構和理化性狀等比GLP-1更加穩定，且不易被降解。目前，GLP-1Ra—利拉魯肽作為治療T2DM藥物已經上市，且效果較好。由于其還具有抗炎作用，尤其對長期慢性炎癥具有良好的抑制效果，而肺臟中GLP-1R表達量均高于其他器官，所以GLP-1Ra有望被開發成為一種抗肺炎藥物。但目前仍有多個問題有待進一步深入探討，如：GLP-1Ra生產成本較高；較大劑量的GLP-1Ra作用中樞神經系統后能抑制食欲，使體重減輕[8]；長期較大劑量使用GLP-1Ra可造成低血糖癥[1]；對GLP-1和GLP-1Ra抗炎作用的機制仍不是十分清楚，而可供臨床研究的案例少之又少，所以對GLP-1和GLP-1Ra作用機制的深入探究帶來不便。但隨著生命科學的不斷發展，以上科學問題定會被徹底解決，并為其作為抗肺炎藥物的研發提供依據。