液相-原子熒光聯(lián)用法測定植物樣品中的無機砷

方芳(江西省地質(zhì)調(diào)查研究院，江西 南昌 330000)

0 引言

砷元素作為常見的有毒非金屬元素之一，極易被動植物吸收并積累到體內(nèi)。因其具有極大的致毒致癌性，威脅到人體的生命健康，所以越來越受到社會的廣泛關(guān)注。而砷在動植物體內(nèi)又常以多種形態(tài)存在，不同形態(tài)砷之間的毒性差異較大[1]。對植物樣品中的無機砷分析測定在保護環(huán)境和人體健康中起著重要作用，因此，為了真實反映植物中砷的安全性，對砷元素的各種形態(tài)進行有效分離和檢測是非常必要的。

目前，液相色譜-原子熒光光譜法作為當前我國無機砷測定最常用的檢測方法，也是國家食品安全標準中使用的第一測定方法[2]。該法測試原理是在植物試樣經(jīng)稀硝酸前處理提取出無機砷化合物，再以液相色譜柱分離，分離后的目標化合物在酸性環(huán)境下與硼氫化鉀反應(yīng)，生成氣態(tài)砷化合物，最后以原子熒光光譜儀進行測定[3]。

1 無機砷形態(tài)分離方法——高效液相色譜法

目前，對于砷形態(tài)分析的常用分離方法主要有色譜法、溶劑萃取法、離子交換法、有氫化物發(fā)生法等。而色譜法是當前對砷形態(tài)分析研究中應(yīng)用最為廣泛的分離方法，色譜法又分為液相色譜和氣相色譜，在對砷的形態(tài)分析過程中，液相色譜法比氣相色譜法更具有優(yōu)越性。其一，在液相色譜中分析樣品不需要衍生，在正常室溫下經(jīng)過簡單處理就可以投入使用。這樣不僅能夠減少植物樣品在檢測過程中所受的污染程度以及氧化過程中的形態(tài)轉(zhuǎn)化誤差，還能夠節(jié)約對于樣品的分析檢時間，一定程度上增加分析結(jié)果的準確性，提高分析數(shù)據(jù)的可靠性。其二，選擇液相色譜法進行測定，可以有多種類的固定相和流動相作為分離介質(zhì)以供選擇。在實驗過程中，根據(jù)不同樣品的性質(zhì)來選擇適當?shù)纳V體系，就使實驗過程在技術(shù)分離方面的選擇更具有靈活性。色譜分離法以其簡單快捷的操作以及可與其他檢測技術(shù)多樣性關(guān)聯(lián)使用進行在線分析，成為目前進行砷形態(tài)分析過程中最常用的分離方法[4]。

2 液相色譜法與原子熒光光譜聯(lián)用技術(shù)

原子熒光光譜法是近幾年砷檢測過程中運用最多的檢測方法，其原理是利用原子熒光譜線的波長和強度進行物質(zhì)的定性以及定量分析方法，是介于原子吸收光譜和原子發(fā)射光譜之間的光譜分析技術(shù)，具有檢出限較低、靈敏度高，譜線簡單、干擾較少，分析校準曲線線性范圍寬，實現(xiàn)多元素同時測定的優(yōu)點。原子熒光光譜法與液相色譜技術(shù)聯(lián)用，能夠有效改善傳統(tǒng)分析技術(shù)檢測中對多形態(tài)元素檢測不足的缺點，利用液相色譜分離技術(shù)分離不同元素的不同形態(tài)，再利用原子熒光光譜技術(shù)來對檢測樣本進行定量檢測，在砷、汞等有毒有害元素及其化合物的形態(tài)分析檢測方面更具有競爭優(yōu)勢[5]。

3 確立研究對象

在實驗方法的研究過程中，具有代表性確立代表性的實驗對象對選擇研究方法優(yōu)化研究過程具有重要作用，因此在實驗過程中選取代表性的植物樣品作為研究對象尤為重要。而植物樣品種類繁多，要對多種不同植物種類中的無機砷形態(tài)進行分析，其實驗過程更為復(fù)雜困難。而由于直接測量樣品中的總砷含量操作過程較為方便簡單，且樣品中總砷含量高有利于對樣品進行分析比較，所以基于前人對不同植物中總砷含量的研究總結(jié)，我們選取總砷含量最高的蕨類植物作為方法研究樣品。

4 材料與方法

4.1 儀器與試劑

儀器：SAP-20液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀(HG-AFS)(北京吉天儀器有限公司)；PRPX-100陰離子交換色譜柱(250×4.6mm，30cm，100A)、砷空心陰極燈、超生清洗器、離心管、燒杯、容量瓶等器皿。

試劑：磷酸二氫銨(分析純)、硼氫化鉀(分析純)、氫氧化鉀(分析純)、硝酸、鹽酸、氨水(優(yōu)級純)、正己烷。

4.2 實驗方法

4.2.1 標準溶液配制

亞砷酸鹽標準儲備液：準確稱取三氧化二砷0.0132g，加100g/L氫氧化鉀溶液1mL和少量水溶解，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，加入適量鹽酸調(diào)整其酸度近中性，加水稀釋至刻度，4℃保存，保存一年。或購買經(jīng)國家認證并授予標準物質(zhì)證書的標準溶液物質(zhì)。

砷酸鹽標準儲備液：準確稱取砷酸二氫鉀0.0240g，水溶解，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中并用水稀釋至刻度，4℃保存，保存一年。

五價砷和三價砷混合標準使用液：分別準確吸取1.0mL三價砷標準儲備液、1.0mL五價砷標準儲備液于100mL容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

4.2.2 儀器條件

液相色譜條件：流動相15mmol/L磷酸二氫銨，pH=6.0；等度流速為1mL/min；梯度流速為0～5min:1mL/min；進樣量為100μL。

原子熒光條件：原子化器負高壓為320V；砷空心陰極燈總電流為90mA；鹽酸作為載流適宜濃度為20%；30g/L硼氫化鉀作為還原劑；載氣流速為400mL/min；輔助氣流速為400mL/min。

4.2.3 前處理方法的確立

首先稱取大約5g的待測植物樣品置于30mL的檢測離心管中，接著向待測樣品中加入10mL1:1甲醇水并將其混合均勻，用超聲波以5000r/min的轉(zhuǎn)速進行超聲提取20min, 離心，20min之后將離心后離心管中樣品的上清液置于提前準備好的小燒杯中，并在離心后的樣品殘渣中加入5mL甲醇水混合均勻繼續(xù)以5000r/min的轉(zhuǎn)速超聲提取20min和離心20min, 最后重復(fù)兩次上述提取過程。將提取過程中轉(zhuǎn)移至小燒杯后的上清液進行氮吹處理，靜待燒杯中的上清液體積小于氮吹前的1/2體積時即可停止。靜置后將之前實驗中的燒杯溶液全部轉(zhuǎn)移至之前準備好的20mL的比色管中，再加超純水進行定容。最后選取相關(guān)濾器來提取實驗所需的樣本液，經(jīng)過水相濾膜過濾后進行上機測定。

4.3 方法驗證

4.3.1 檢出限

檢出限是指生物樣品中按照分析方法的要求進行提取處理并檢測，能區(qū)分于噪聲的最低檢出濃度。檢出限的對應(yīng)響應(yīng)值至少為噪聲的3～5倍。本實驗過程通過多次對樣本進行空白重復(fù)，得到儀器噪聲的平均值，并在三價砷和五價砷濃度為范圍內(nèi)制作出標準曲線，找到了對應(yīng)無機砷的儀器測量度，得到無機砷的最小檢測濃度，結(jié)果表明標準曲線線性關(guān)系良好，檢出限符合檢測需求。

4.3.2 方法準確度

為了進一步檢測此研究方法的準確性和精密度，在空白植物樣本中加入濃度為20.00μg/L的無機砷形態(tài)進行連續(xù)進樣，經(jīng)過甲醇水超聲提取后，測量植物中的無機砷加標回收率。因植物樣本中本身含水量大，增加了基體的干擾性，所以樣本中無機砷回收率達到80%即可達到要求。經(jīng)過實驗并對樣本中的無機砷微量進行分析發(fā)現(xiàn)，通過本方法檢測的回收率達到80%，滿足形態(tài)分析要求，從而證明了此研究方法有較高的準確度。

4.3.3 方法重復(fù)性

以砷濃度為100μg/L的標準溶液為基礎(chǔ)，連續(xù)測定四次，通過分析其峰高測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一植物樣本的四次測定中，無機砷的測定值相對標準偏差都控制在5%以內(nèi)，這表明此研究方法重復(fù)性好，更夠滿足植物樣品中無機砷的檢測要求。

5 結(jié)果與分析

5.1 流動相優(yōu)化處理

在液相色譜分離中，廣泛使用的流動相有磷酸鹽、有機二元酸、檸檬酸鹽等，將這些溶液與其相應(yīng)的酸進行混合。本次實驗過程選擇磷酸銨鹽緩沖液作為流動相，考察pH值為6.0時不同濃度的流動相對無機砷保留時間的影響。經(jīng)實驗可知，當pH為6.0時，無機砷的保留時間隨流動相濃度的變化而變化：當流動相的濃度增加大于25mmol/L時，無機砷的保留時間緩慢縮短，無機砷不能得到很好的分離；當流動相濃度小于15mmol/L時，無機砷形態(tài)得到了清晰的分離；而當流動相濃度較低為10mmol/L時，由于保留時間過長，不利于對其定量。因此選擇15mmol/L作為流動相的優(yōu)化濃度。

5.2 提取劑優(yōu)化處理

不同于總砷的檢測方法，為了在檢測過程中不造成對有機砷的轉(zhuǎn)化，無機砷的檢測過程一般不對植物樣品進行消解處理，因此，提取效率是準確測定無機砷的關(guān)鍵因素[6]。提取劑作為實驗過程前處理階段保證所測樣品無機砷形態(tài)高提取率的關(guān)鍵，也是檢測實驗方法準確度至關(guān)重要的因素。因此在本實驗過程中選取最優(yōu)提取劑進行實驗尤為重要。在提取劑優(yōu)化處理過程中，采用超聲提取方式進行優(yōu)化，并分別考察甲醇溶液、乙醇溶液、鹽酸溶液等提取劑對植物樣本中砷形態(tài)的總提取量。實驗結(jié)果證明，乙醇溶液溶解的有機物較多，雖然能夠輕松提取樣品中的可溶性有機物，但其強溶解性也使樣品溶解液變色且粘稠，這種情況會導(dǎo)致實驗結(jié)果中對樣品的提純不完全，不利于樣品無機砷的提取。而無論對于陸生植物還是水生植物，甲醇水樣品提取率都較為理想，且操作過程簡單，因而被廣泛使用。用體積比為1:1、1:2、2:1、3:1的甲醇水對蕨類植物進行提取后測量總砷含量可得，在一定操作范圍內(nèi)，樣品中無機砷的提取率會隨著甲醇溶液濃度的變化而變化，甲醇溶液濃度高提取率就高，但樣品提取率增大到一定程度又會隨著甲醇溶液濃度的增大而降低，這一定程度上是因為甲醇含量過大而導(dǎo)致提取出樣品中的有機物而導(dǎo)致，會干擾到測定的準確度，因此選擇1:1作為提取劑的體積比[7]。

6 結(jié)語

本試驗采用液相色譜-原子熒光光譜法測定植物樣本中的無機砷，并在實驗過程中對儀器參數(shù)設(shè)定和工作條件進行優(yōu)化，測得試驗樣品平均回收率在80.0%～88.0%之間，相對標準偏差都控制在5%以內(nèi)。因此表明該檢測方法具有良好的準確性。但在實驗過程中也存在很多不足。首先因為植物種類繁多、基體復(fù)雜，不能對全部種類植物進行檢測，可能使本研究確立的無機砷形態(tài)分析法對個別樣品存在不適用情況，因此應(yīng)該做到具體問題具體分析。由于植物樣中的含水量較大，總砷含量較低，因此對此類樣品中的無機砷含量測定存在不穩(wěn)定性，有望向檢出限更低、回收率更高、靈敏度更強的檢測方向發(fā)展。